Estabelecimento da metodologia CRISPR/Cas9 e obtenção de plantas knockout para genes candidatos a reguladores do splicing alternativo sob estresse térmico em arroz (Oryza sativa L.)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Servilha, João Henrique
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41132/tde-28062024-115330/
Resumo: O arroz é um dos alimentos mais consumidos no mundo, mas o estresse térmico afeta seu rendimento e qualidade dos grãos. Para identificar soluções mecanísticas que melhorem essa cultura diante das ameaças das mudanças climáticas, as respostas moleculares da termotolerância devem ser identificadas. O splicing alternativo de pré-mRNAs é um dos mecanismos envolvidos na resposta das plantas contra estresses, mas pouco se sabe sobre como a variação de isoformas transcritas é regulada por mudanças de temperatura. Os genes de arroz LOC_Os02g40900 e LOC_Os05g30140 são candidatos a reguladores de splicing sensíveis ao calor. Para investigar essa hipótese, foram gerados plasmídeos com base na metodologia CRISPR/Cas9 visando editar esses genes em plantas de arroz. Utilizando a estratégia de duplo direcionamento, foram escolhidas duas sequências-alvo na região codificante de cada gene. Essas sequências-alvo foram inseridas em vetores de expressão de plantas via PCR, subclonagem e Golden Gate Assembly. Os plasmídeos adequados foram confirmados por sequenciamento de Sanger e então inseridos em Agrobacterium, sendo confirmados por PCR de colônias. Para a transformação de plantas, calos de arroz foram obtidos induzindo a divisão de embriões indiferenciados em sementes de arroz. Após a indução e subcultivo dos calos, ocorreu a transformação via Agrobacterium, permitindo que os calos resistentes ao agente seletivo prosseguissem para o meio de regeneração, gerando plantas transgênicas, confirmadas por PCR e sequenciamento de Sanger para, pelo menos, uma das edições esperadas.
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