Caracterização estrutural das septinas de levedura (Saccharomyces cerevisiae) Cdc3, Cdc10, Cdc11 e Cdc12

• Autor(a) principal: Silva, Rafael Marques da
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-17082022-083225/
• topic: Cristalografia; Crystallography; Leveduras; Septinas; Septins; Yeast

Septinas são proteínas estruturais que normalmente apresentam atividade GTPasica, desempenhando um papel importante na estrutura da célula e servindo como um arcabouço no recrutamento de proteínas parceiras. Estas proteínas são encontradas nos mais diferentes tipos de forma de vida, como protozoários, fungos e animais. Para realizar suas funções, as diferentes septinas formam filamentos que são estabilizados por interações entre as subunidades através de dois tipos de interface, chamadas de G e NC. Em levedura quatro proteínas se arranjam de modo a formar um octâmero linear, cuja ordem das proteínas é Cdc11-Cdc12-Cdc3-Cdc10-Cdc10-Cdc3-Cdc12-Cdc11. Este octâmero por sua vez se polimeriza através das suas extremidades com outros octâmeros, dando origem a filamentos de maior complexidade. Compreender os mecanismos moleculares exatos que controlam a montagem correta dos filamentos individuais e posteriormente seu empacotamento em estruturas de ordem superior atualmente representa um dos maiores desafios na área de bioquímica de septinas. Das quatro proteínas mencionadas acima, apenas Cdc11 foi cristalizada e teve a estrutura reportada 1. Porém, os dados relacionados a esta septina são de muito baixa qualidade, onde se observam sérios problemas de ordem estereoquímica, cristalográfica e estatística. Por este motivo, este trabalho buscou redeterminar a estrutura da Cdc11 usando o protocolo da literatura para depois estender os estudos estruturais para outras septinas de levedura. Este trabalho também analisou propriedades biofísicas das quatro proteínas citadas, como estado monomérico em solução, estabilidade térmica, capacidade de ligar-se a nucleotídeo de guanina e também a hidrólise de GTP. Verificou-se que Cdc3 e Cdc11 quando sem a septina parceira são monômeros em solução e são purificados livres de nucleotídeos, diferentemente do que ocorre com Cdc12 que possui tanto GDP quanto GTP em seu interior devido à sua atividade catalítica. Também foi realizada a co-expressão de Cdc3/Cdc10 e Cdc11/Cdc12 que resultou em dímeros que permitiram a purificação de Cdc12 e Cdc10 por meio de SEC. Cristais proteicos foram obtidos para as septinas Cdc11 e complexos Cdc3/Cdc10 e Cdc11/Cdc12, que infelizmente difrataram em baixa resolução (4 5 Å) não permitindo a elucidação da estrutura cristalográfica. Em vista dos parâmetros ruins de validação da estrutura depositada de Cdc11, esta proteína foi modelada sozinha, com a sua parceira Cdc12 via interface G e também com outra cópia de Cdc11 via interface NC, cujos modelos são preferíveis à estrutura depositada.