Clonagem, expressão e purificação de alfa receptores de folato de Homo sapiens para aplicações bioanalíticas em câncer

• Autor(a) principal: Miranda, Beatriz Nogueira Messias de
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-29012015-171032/
• topic: Biomarcador; Biomarkers; Cancer; Câncer; Clonagem; Cloning; Expressão heteróloga; Folate receptors; Heterologous expression; Receptores de folato

Nos últimos anos a incidência do câncer tem crescido significativamente mundialmente, porém, as técnicas atualmente empregadas para a detecção da doença não são individualmente conclusivas, além de serem extremamente invasivas e não permitirem seu diagnóstico precoce, o que justifica o desenvolvimento de novas tecnologias alternativas para a detecção do câncer. Células cancerígenas possuem receptores específicos de alta afinidade com folato e por serem altamente replicativas, são extremamente dependentes do suprimento de folato reduzido. Os alfa-receptores de folato (FR α) são proteínas com propriedades bioquímicas específicas as quais podem ser exploradas pela estratégia de marcação para detecção e tratamento do câncer (biomarcadores). Com raras exceções, são induzidos seletivamente em tecidos cancerígenos e raramente expressos em células normais, mostrando-se, assim, altamente seletivos e específicos. Sendo assim, neste projeto objetivou-se a expressão e a purificação dos FR α, além da sua imobilização em microssistema para estudos subsequentes em biossensores. Foram promovidos testes de expressão da proteína heteróloga (rFR α) em E. coli em diferentes linhagens, temperaturas e tempos de indução da expressão sendo observada a expressão da proteína recombinante de forma insolúvel. Paralelamente foram promovidos testes de expressão da proteína rFR α em P. pastoris, os quais não se mostraram eficientes, uma vez que não foi possível a detecção da proteína em estudo. Como alternativa, uma nova construção, em fusão com a proteína Trigger fator (TF) de E. coli, uma chaperona molecular de alta solubilidade, foi testada. Através de análises por SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL e espectrometria de massas, foi possível comprovar a produção da proteína recombinante TFFRα. Ainda, a proteína foi imobilizada em lipossomos, o que proporcionou o desenvolvimento de um padrão analítico que poderá ser utilizado em estudos subsequentes com biossensores de FR α. Este estudo será útil para o desenvolvimento de drogas visando a inativação desta proteína, como os anti-folatos, que são hoje os agentes anti-neoplásicos mais investigados, e possibilitará a caracterização bioanalítica da proteína FR α recombinante (rFR α) bem como o desenvolvimento de novos biossensores.