Silenciamento gênico de Diatraea saccharalis utilizando a técnica de RNA de interferência (RNAi)

• Autor(a) principal: Factor, Bruna Garbatti
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-13022023-101833/
• topic: Bacteria; Bactérias; Insect pests; Insetos-praga; Post-transcriptional silencing; RNA de interferência; RNA interference; Silenciamento pós-transcricional

O uso da técnica de RNAi vem sendo apontado como uma estratégia inovadora que pode ser integrada no manejo de importantes pragas agrícolas. Diatreaea saccharalis é considerada uma das principais pragas da cana-de-açúcar. Os danos econômicos gerados à cultura são bastante consideráveis. A cada safra, R$ 5 bilhões são perdidos no Brasil em decorrência do ataque desta praga. A junção destes fatores implica, portanto, numa demanda por outros métodos de controle. O silenciamento gênico por RNAi surge como potencial de uso para o controle de D. saccharalis. Logo, o objetivo do trabalho foi avaliar o transcriptoma de D. saccharalis e identificar os relacionados a maquinaria de RNAi nesta espécie, bem como potenciais genes alvos para silenciamento gênico. Além disso, avaliar o silenciamento de genes de D. saccharalis, utilizando o método de entrega de dsRNA via bactéria E. coli HT115 (DE3), disponibilizada em dieta artificial. Ainda, buscou-se realizar a identificação, caracterização e knockdown do gene relacionado a uma proteína de degradação de dsRNA em insetos, principalmente lepidópteros, a REase de D. saccharalis, objetivando maior acúmulo de dsRNA e melhor eficiência RNAi no inseto. Também, estudou-se a criação de um método de entrega de dsRNA para lagartas de D. saccharalis, via bactérias endofíticas Pantoea agglomerans 33.1. Para isto, foi necessário realizar primeiramente o knockout do gene rnc do microrganismo, e posterior transformação para expressão de dsRNA. No geral, foram encontrados contigs homólogos de todos os componentes da rota de RNAi. Além disso, genes envolvidos em rotas de hormônios, resistência a inseticidas e ao trato digestório do inseto foram identificados como candidatos ao silenciamento gênico via RNAi. A partir da avaliação dos parâmetros biológicos (duração da fase larval, mortalidade larval e peso de pupas), pudemos demonstrar com a entrega de dsRNA contra genes alvos específicos do inseto, expressos em bactérias E. coli HT115 (DE3), a ausência de evidências de efeitos de silenciamento gênico, presumindo-se que, tal como ocorre na maioria dos insetos da ordem Lepidoptera, D. saccharalis apresenta recalcitrância aos mecanismos de RNAi. Além disso, a identificação e o knockdown do gene Ds_up56, que codifica REase em D. saccharalis, reduziu em 3,5 vezes o acúmulo de transcritos de CHI demonstrando a contribuição deste gene para a degradação de transcritos do gene alvo e aumentando a eficiência RNAi, justificando a recalcitrância de D. saccharalis ao RNAi. Por fim, com o knockout do gene rnc de P. agglomerans 33.1 e com a transformação deste microrganismo com vetor de silenciamento pdag para expressar dsRNA contra um gene específico de D. saccharalis, demostramos a ocorrência de acúmulo de dsRNA no hospedeiro bacteriano, propondo a utilização de P. agglomerans 33.1Δrnc como vetor de entrega RNAi para o controle de insetos-praga, demonstrando ser uma alternativa potencial para a proteção de culturas agronômicas relevantes.