Regeneração de plantas e expressão transiente de Gus em Stylosanthes guianensis(Aubl.) Sw. via Agrobacterium

• Autor(a) principal: Hoffmann, Lucia Vieira
• Data de Publicação: 1996
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20191108-105318/
• topic: TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA; CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS; ESTILOSANTE; EXPLANTES; PLANTAS TRANSGÊNICAS; REGENERAÇÃO

Com o objetivo de estabelecer um protocolo de transformação de Stylosanthes guianensis via Agrobacterium foram estabelecidos primeiramente protocolos de cultura de tecidos para explantes derivados de hipocótilo superior, hipocótilo inferior, cotilédone, folíolos e raízes dos cultivares Mineirão e Bandeirantes. Houve pelo menos uma combinação dos reguladores de crescimento NAA (ácido alfa naftalenoacético) e BAP (6-benzilaminopurina) que propiciaram 100% de regeneração de brotos, exceto a partir de explantes cotiledonares de ambos os cultivares e raízes do cultivar Mineirão, onde observou-se regeneração da ordem de 67%. Os explantes mais eficientes foram hipocótilos superiores e inferiores do cultivar Mineirão, que deram origem, em média, a 20 e 16,7 brotos por explante, respectivamente. Os demais explantes apresentaram médias entre 2 a 10 brotos. As linhagens A208 e T37 de Agrobacterium tumefaciens e as linhagens 8196, A4 e A4T de A. rhizogenes causaram aparecimento de tumores em hipocótilos excisados de plântulas do cv. Bandeirantes germinadas in vitro. Os ferimentos causados pela inoculação levaram à formação de brotos nestes locais. A suscetibilidade ao Agrobacterium dos explantes com capacidade de formar brotos, na presença de ferimentos, pode consistir em um método alternativo para transformação de Stylosanthes, sem necessidade do uso de cultura de tecidos. Nos experimentos de transformação, foram utilizados os plasmídeos pEA24 e pEA ATS:2S, que contêm o gene da albumina 2S da castanha do Pará, rico em metionina, ligado ao gene uidA e ao marcador seletivo NPTII. A eficiência da transferência genética foi avaliada através de ensaio de GUS, 48 horas após o término do cocultivo, e demonstrou-se a eficiência do procedimento de inoculação utilizando-se explantes derivados de hipocóilos e raízes. Foram feitos dois experimentos de transformação com o cultivar Bandeirantes (303 explantes) e três com o cultivar Mineirão (753 explantes), inoculados, respectivamente, com as linhagens GV3101 (pEA24) e GV2260 (pEA24). O uso de controles permitiu concluir que a lavagem em tetraciclina não prejudicou a regeneração, e o cefotaxime teve efeito similar ao de uma auxina, aumentando a formação de calo e atrasando a formação de brotos. A kanamicina foi ineficaz como agente seletivo porque permitiu a formação de brotos não transformados e teve uma ação desuniforme, isto é, formaram-se brotos verdes não-transgênicos e brotos necróticos muito próximos, em um mesmo calo. Sugere-se então pela não utilização deste agente seletivo em experimentos de transformação com o cultivar Mineirão.