Utilização da GFP (Green Fluorescent Protein) na análise da evolução dirigida da 'beta'-glucosidase a de Fervidobacterium sp

• Autor(a) principal: André Oliveira de Souza Lima
• Data de Publicação: 2001
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://doi.org/10.11606/T.11.2001.tde-20200111-151230

As enzimas são amplamente empregadas na indústria (fármacos, alimentos, tintas, biodegradação, etc), devido a sua capacidade de catalisar reaçoes biológicas. Atualmente, a evolução dirigida permite a obtenção de enzimas mais eficientes e/ou estáveis. Este método consiste em gerar variabilidade por meio do PCR, introduzindo mutaçoes aleatórias na molécula de DNA que codifica a proteína de interesse. Em seguida, faz-se a clonagem do DNA mutante e, posteriormente, a avaliação e seleção dos clones desejáveis expressando a proteína de interesse. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo integrar à este sistema de melhoramento de proteínas, a utilização da Green Fluorescent Protein (GFP) como um gene repórter, a fim de que este, por meio de sua fluorescência, auxiliasse o processo de seleção das moléculas mais ativas. Neste estudo, foi utilizada como modelo a ẞ-glucosidase A (BgIA) de Fervidobacterium sp. (Sullí­van et al., 1998), de interesse na biodegradação da celulose devido a sua termoestabilidade. O gene desta enzima, bem como o da GFP (pGFPmut3.1, Clontech), foram clonados num vetor de expressão (pBADMycHis, Invitrogen) induzí­vel por arabinose. Para tanto, uma série de plasmídios, bem como uma nova variável da GFP (GFP309), foram criados resultando nos vetores pBBGH e pBBSGH. Estes vetores binários conferiram às células de Escherichia coli a capacidade de produção de uma proteína quimérica ativa, composta pela BgIA fusionada à GFP, seguida de uma cauda de 6 histidinas. A produção desta fusão foi otimizada, seguida de sua purificação (Imobilized Metal Affinity Chromathography - IMAC) caracterização (temperatura ótima, especificidade pelo substrato, termoestabilidade, etc). Foram estabelecidas as condiçoes para a obtenção de moléculas mutantes da BgIA por meio da técnica de Error Prone PCR (EPP), sendo construída uma biblioteca de clones mutantes, que foram avaliados por meio do índice obtido entre a atividade da BgIA e a fluorescência da GFP (BgIA/GFP). Os clones com superior índice (BgIA/GFP) foram selecionados e suas respectivas fusões purificadas e caracterizadas. Não foi verificada correlação entre este í­ndice e a atividade especifica da BgIA nas fusões mutantes purificadas. Aqui são sugeridas as fontes de variação que reduziram a correlação entre estes parâmetros e, entre elas, são consideradas: a interação entre as moléculas que compõem a fusão, a instabilidade plasmodial, a suscetibilidade da fusão á proteólise e a não automatização total dos ensaios.