Expressão do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante (rhG-CSF) em sistema Pichia pastoris e otimização do bioprocesso

• Autor(a) principal: Archangelo, Bruna Samhan
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-23112017-101039/
• topic: Central composite design; Delineamento composto central; Delineamento experimental; Experimental design; G-CSF; G-CSF; Pichia pastoris; Pichia pastoris; Plackett-Burman; Plackett-Burman; Screening design; Screening design

O fator estimulador de colônias de granulócito humano (hG-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos. Tem sido utilizado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas por eventos que suprimem a produção de células mieloides. No Brasil, este medicamento está inserido no Programa de Assistência Farmacêutica do SUS como medicamento excepcional, porém a um altíssimo custo para aquisição, pois ainda não é produzido no Brasil. Um estudo de viabilidade técnico-econômica da implantação da produção de rhG-CSF no Brasil demonstrou que esse medicamento pode ser produzido por custos até cerca de 90% inferiores aos valores pagos em compras governamentais. Este trabalho mostra a clonagem e expressão do rhG-CSF em sistema heterólogo de P. pastori e visou estabelecer os melhores parâmetros para a indução e produção da mesma em diferente condições de cultivo, além de uma caracterização da linhagem produtora. A construção do plasmídeo de expressão foi feita com o vetor pPICZαA e confirmada por sequenciamento nucleotídico. Após a transformação em P. pastoris, algumas colônias foram testadas para avaliar as condições da expressão da proteína recombinante. A colônia que apresentou uma expressão melhor foi escolhida a produção da proteína recombinante em uma escala maior. A detecção da proteína recombinante foi realizada por SDS-PAGE, Western Blotting e Dot Blotting. O planejamento Plackett-Burman foi aplicado para selecionar as variáveis significantes, que foram o pH e a adição de Sorbitol e aminoácidos no meio de cultura. Os dados obtidos passaram por análise estatística que permitiu esta seleção. O Delineamento Composto Central foi aplicado para uma análise em níveis maiores das variáveis significativas. Também foi feita uma caracterização de linhagem para que a colônia selecionada fosse caracterizada como uma linhagem produtora. Apesar das três variáveis terem sido significativas (pH, sorbitol e aminoácidos), apenas o aumento do valor de pH apresentou um efeito benéfico para a produção da rhG-CSF. Curvas de crescimento celular foram desenhadas, além do cálculo da velocidade máxima de crescimento e tempo de duplicação. Estes resultados mostram a produção da rhG-CSF em P. pastoris e estes são os primeiros passos para uma estratégia de tornar o Brasil um produtor deste biofármaco futuramente, além de contribuir para estudos de otimização de bioprocessos.