Desenvolvimento do método SALLE-UHPLC-MS/MS para a determinação de anandamida e 2-araquidonoilglicerol em amostras de encéfalos de ratos submetidos a modelo animal da Doença de Parkinson

• Autor(a) principal: Oliveira, Igor Gustavo de Carvalho
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-19082020-144507/
• topic: Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem; Doença de Parkinson; Encéfalos de ratos; Endocanabinóides; Endocannabinoids; Extração líquido-líquido assistida por salting-out; Liquid chromatography tandem mass spectrometry; Parkinsonss disease; Rat brain samples; Salting-out assisted liquid-liquid extraction

Os endocanabinóides (ECs), anandamida (AEA) e 2-araquidonoilglicerol (2-AG), juntamente dos receptores celulares canabinóides (CB1 e CB2) e enzimas metabólicas, fazem parte do chamado sistema endocanabinóide (eCB). Estudos realizados indicam que os níveis endógenos desses ECs sofrem alterações à estímulos fisiológicos, farmacológicos e patológicos, fazendo com que a determinação de suas concentrações em amostras biológicas sejam alvo de estudos de diversas patologias, com destaque às doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (DP). Modelos experimentais em animais têm sido desenvolvidos para mimetizar as características da DP observada na clínica em humanos, comumente, a injeção aguda seletiva de neurotoxinas, como o análogo hidroxilado da Dopamina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos, é usada para criar lesões neurodegenerativas agudas das vias nigro-estriatais. A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) tem sido considerada a técnica analítica de referência para a determinação de endocanabinóides em amostras biológicas. A extração líquido-líquido assistida por \"salting-out\" (SALLE) é uma técnica de extração baseada no efeito de \"salting-out\", que consiste na redução da miscibilidade mútua entre a água e um solvente orgânico miscível em água pela adição de um eletrólito. Como consequência da adição do sal, os analitos orgânicos não carregados presentes na amostra sofrem redução de solubilidade na fase aquosa, favorecendo a migração para a fase orgânica. O objetivo deste projeto foi o desenvolvimento de método SALLE/UHPLC-MS/MS para a determinação de AEA e 2-AG em amostras de encéfalos de ratos induzidos ao parkinsonismo. O procedimento SALLE desenvolvido apresentou como vantagens menor consumo de solvente orgânico e menor tempo de análise, quando comparado às técnicas de extração líquido-líquido e extração em fase sólida, e extratos mais limpos, em razão da separação de fases orgânica/aquosa, quando comparado à precipitação de proteínas. O método SALLE-UHPLC-MS/MS foi validado, apresentando linearidade de 2,00 a 20,00 ng/mL para AEA e 0,300 a 10,00 &micro;g/mL para 2-AG, valores de exatidão (EPR) e precisão (CV) intra e inter-ensaio abaixo de 15% e efeito matriz não significativo. O método proposto foi aplicado com sucesso na determinação das concentrações endógenas de AEA e 2-AG em amostras de encéfalo total, de hemisférios e estriados de ratos parkinsonianos e ratos sadios do grupo controle. Para AEA, verificou-se diferença significativa (p<0,05), entre os estriados ipsilateral e contralateral à lesão. Já ao comparar esses dois grupos de estriados com os estriados dos animais sadios, observou grande diferença estatística (p<0,001). Para 2-AG, observou-se grande diferença estatística (p<0,001) ao se comparar as concentrações entre os estriados ipsilateral e contralateral à lesão. Da mesma forma, observou-se grande diferença estatística (p<0,001) entre os estriados ipsilateral e contralateral dos animais lesionados com os animais sadios.