Melatonina no cultivo in vitro de embriões bovinos: dinâmica e ação antioxidante

• Autor(a) principal: Assis, Patrícia Monken de
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-16032015-162004/
• topic: AFMK; AFMK; Caspase; Caspase; Cultivo; Culture; Desenvolvimento; Development; Estresse oxidativo; Oxidative stress

A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5&micro;M de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p&lt;0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p&lt;0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p&lt;0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p&lt;0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p&lt;0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido. A melatonina (MEL) é uma indolamina lipofílica com conhecida ação antioxidante por via direta, através da formação e ação de seus metabólitos, dentre eles o N1-acetil- N2- formil-5 metoxikinuramina (AFMK), ou por ação via receptores de membrana (MT1 e MT2). No entanto, não se sabe a dose ideal para utilização e sua estabilidade nos diferentes sistemas de cultivo in vitro (CIV) embrionário bovino. Neste trabalho, para avaliar se há perda de MEL para o sistema de CIV, determinou-se pela técnica de HPLC a concentração real de melatonina no meio CIV em sistema com e sem óleo mineral após a adição de diferentes doses iniciais de MEL (DM; 0, 25, 50, 100ng/ml), e assim, avaliadas em diferentes tempos de incubação (0, 24, 72 e 144 horas). Em seguida, avaliou-se a ação e consumo da melatonina no CIV de embriões submetidos ao estresse oxidativo induzido. A CIV foi realizada em atmosfera controlada (38,5ºC, 5% O2, 5% CO2 e 90% N2). No quinto dia de cultivo embriões, que apresentavam no mínimo 16 células, foram divididos aleatoriamente entre os grupos 0, 25, 50 e 100ng/ml de MEL, e todos receberam indução com 5µM de menadiona durante 24 horas. Após este período, o meio foi coletado para análise de HPLC (MEL e AFMK) e os embriões foram cultivados apenas com as DM até D8. Os blastocistos (D8) foram destinados para avaliação de espécies reativas de oxigênio (ROS), contagem de blastômeros (nBLAST), detecção de atividade de caspase-3 e -7 (CASP) através de microscopia confocal de epifluorescência, e expressão gênica (GRP78, SOD1 e HSP60). Foi também analisada a taxa de blastocisto (TXBL). Constatou-se que não há migração para o óleo, ou degradação da MEL ao longo do tempo de CIV. Na utilização da dose de 50ng/ml de MEL no cultivo de embriões com estresse oxidativo induzido há consumo da melatonina no meio e formação de AFMK (p<0.05), maior TXBL (45,93 vs. 33,06%, p<0.05) e nBLAST (143 vs. 93,1, p<0.05), e redução de ROS (0,84 vs. 1,66 pixels, p<0.05) e CASP (0,91 vs. 1,54 pixels, p<0.05), se comparado ao grupo sem MEL. Contudo, não houve alteração na expressão gênica. Conclui-se que a melatonina mostrou comportamento estável nas condições de cultivo, podendo ser usada em sistemas com e sem óleo e possui ação antioxidante na dose de 50ng/ml, aumentando a produção e qualidade de embriões in vitro submetidos ao estresse oxidativo induzido