Preparação de nanobiosistemas para detecção do microRNA tumoral miR-21.

• Autor(a) principal: Souza, Marcelo Medina de
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42134/tde-14022020-100006/
• topic: AuNPs; AuNPs; bioconjugação; bioconjugation; cancer detection; detecção de câncer; microRNAs; microRNAs; miR-21; miR-21

Nessa tese foi desenvolvido um método para obtençãode sondas de DNA baseadas em nanopartículas de ouro, aqui denominadas nanobiossistemas, que utiliza baixas concentraçõesde cloreto de sódio e DNA e reduzido tempo de reação. Essas sondas foram utilizadas em ensaios de detecção do microRNA tumoral miR-21 maduro por meio de espectroscopia Raman e espectroscopia e microscopia de fluorescência. As AuNPs foram sintetizadas pelo processo de redução do citrato e apresentaram tamanho médio de 17 nm e ressonÇancia de plasmon de superfície (SPR) em _ 524 nm, verificados por microscopia eletrônica de transmissão e espectroscopia UV-Visível, respectivamente. Os nanobiossistemas foram preparados em 2 etapas, que consistem na estabilização da suspensão de AuNPs com dATP e PEG-SH e posterior substituição do dATP por oligonucleotídeos modificados com um grupo tiol e um fluoróforo Cy5 nas porções 5 e 3, respectivamente. Os nanobiossistemas foram caracterizados por espectroscopia UV-Visível, espalhamento de luz dinâmico, potencial Zeta e microscopia eletrônica de transmissão. Após as modificações, ambos os nanobiossistemas apresentaram um deslocamento na banda RPSL para _ 530 nm e uma banda em 260 nm, que é caracter ística dos oligonucleotídeos, e tamanho hidrodinâmico de 38 nm. O potencial Zeta passou de -21 mV para aproximadamente -38 mV para os nanobiossistemas. Esses resultados mostram que o método aqui desenvolvido foi útil para funcionalizar a superfície das AuNPs com oligonucleotídeos de modo simples e rápido. Para avaliar a capacidade de detecção miR-21 foi testado a hibridização do miR-21 proveniente de 3 fontes: sintético, obtido comercialmente, extraído de vesículas extracelular e intracelular em células das linhagens celular tumoral MCF-7 e epitelial de mama MCF-10A. Para a linhagem MCF-7, as detecções por espectroscopia de fluorescência apresentaram um limite de detecção de 0,18 nM e limite de quantificação de 0,55 nM, para o miR-21 sintético. Enquanto a espectroscopia Raman apresentou um limite de detecção de 6,7 nM e limite de quantificação de 20,4 nM. Ambos nanobiossistemas apresentaram boa especificidade, pois foram capazes de distinguir entre sequência de miR-21 com apenas uma base alterada. Para os testes de detecção com miR-21 proveniente de vesículas extracelular, o limite de detecção foi de 214 ng/mL de miR-21 e limite de quantificação 651 ng/mL e limite de detecção 0,74 ng de miR-21 e limite de quantificação 2,24 ng/mL, para a espectroscopia Raman e de fluorescência, respectivamente. Esses resultados mostraram que a espectroscopia por fluorescência foi mais sensível para detecção do miR-21, quando comparado ao Raman. Foram realizados também testes de detecção intracelular em células MCF-7 e MCF-10A utilizando imagens de fluorescência. Os resultados mostraram que o nanobiossistema baseado em fluorescência é sensível à diferença de expressão entre células tumorais e células normais, como foi verificado por meio da RT-qPCR.