Avaliação bioquímica, funcional e modificação química por PEGuilação do fator de crescimento endotelial vascular da peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus

• Autor(a) principal: Ferreira, Isabela Gobbo
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-19072023-151811/
• topic: Cellular migration; Crotalus durissus terrificus; Crotalus durissus terrificus; Fator de crescimento endotelial vascular; Migração celular; Peçonha de serpente; PEGuilação; PEGylation; Snake venom; Vascular endothelial growth factor

As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Portanto, estudar os diversos componentes presentes nessas peçonhas permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. No Brasil, as serpentes do gênero Crotalus, representado pela espécie Crotalus durissus, habitam diversas regiões do país e suas peçonhas são compostas por grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), componentes não enzimáticos como carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. No entanto, diversos componentes ainda não foram caracterizados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) de Crotalus durissus terrificus. Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massa molecular variando entre 20 e 30 kDa, com papel fundamental na angiogênese (crescimento de novos vasos), aumento de permeabilidade vascular, ação hipotensora, indução de migração celular e ação cardioprotetora em isquemias. No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está totalmente elucidado. Diante disso, os objetivos do presente foram o isolamento e caracterização bioquímica, modificação química por bioconjugação com molécula de polietilenoglicol (PEGuilação) e avaliação funcional do VEGF da peçonha de Crotalus durissus terrificus (CdtVEGF). O isolamento do CdtVEGF foi realizado por meio de combinação de duas técnicas de cromatografia líquida como fase reversa e troca aniônica, respectivamente, sendo seu rendimento de 2%. A modificação química do CdtVEGF foi efetiva com a molécula de polietilenoglicol mPEG-maleimide de 5 kDa, sendo o PEG-CdtVEGF purificado por meio de cromatografia líquida de fase reversa em coluna C4 e esta PEGuilação foi confirmada por ELISA e espectrometria de massas (MALDI-TOF) com massa molecular de 31241.4 Da para o PEG-CdtVEGF. Por meio de análise em SDS-PAGE, o CdtVEGF migrou como homodímero sendo confirmado por espectrometria de massas por MALDI-TOF apresentando massas moleculares de 25524.0 Da para o dímero e 13315.7 Da para o monômero. Por LC/MS/MS foi possível determinar uma sequência para o CdtVEGF formado por 114 resíduos de aminoácidos. Por ELISA foi possível observar que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan reconhece o CdtVEGF e, por análise in silico, foram identificados 12 possíveis epítopos imunogênicos na molécula. Por meio de análise in vitro, CdtVEGF nativo e PEG-CdtVEGF tiveram influência na atividade metabólica de células endoteliais vasculares umbilicais (HUVECs) de linhagem humana, em todas as concentrações testadas (0,01; 0,1; 1; 5; 10 e 100 nM) sendo que essa influência está relacionada com a proliferação destas células. Além disso, as proteínas (5 nM) induziram migração celular da mesma linhagem, no ensaio de wound healing sendo que o CdtVEGF nativo teve uma atividade mais potente que o PEG-CdtVEGF. Nos ensaios in vivo, realizados com camundongos machos da linhagem C57Bl/6, o CdtVEGF nativo (0,01; 1 e 5 nM) foi capaz de influenciar no recrutamento de leucócitos para a cavidade intraperitoneal dos animais de maneira dose-dependente, aumentando preferencialmente o influxo de neutrófilos. Sua ação sobre a permeabilidade vascular foi confirmada com o aumento de proteínas nos exsudatos peritoneais. Interessantemente, o PEGCdtVEGF, nas mesmas concentrações testadas, não teve influência nesses parâmetros, indicando que a PEGuilação foi capaz de diminuir a resposta inflamatória local que o CdtVEGF induziu. Este trabalho apresenta grande relevância científica por ser pioneiro no que se refere à purificação, PEGuilação e estudo funcional de um VEGF da peçonha de C. d. terrificus. Adicionalmente, os resultados obtidos contribuem para a aplicação desta molécula em modelos de estudo de doenças isquêmicas, cicatrização de feridas, além de poder ser utilizada como uma ferramenta molecular no estudo de patologias que envolvem a angiogênese.