Aplicação da proteômica e metabolômica no entendimento da interação de Austropuccinia psidii durante o processo de infecção de Eucalyptus grandis e Syzygium jambos

• Autor(a) principal: Tschoeke, Bruno Augusto Prohmann
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11138/tde-16062021-123425/
• topic: A. psidii; A. psidii; E. grandis; E. grandis; S. jambos; S. jambos; Interação patógeno-planta; Metabolômica; Metabolomics; Pathogen-plant interaction; Proteômica; Proteomics

Os fungos causadores da doença conhecida como ferrugem são um dos grupos mais específicos de patógenos obrigatórios em plantas. Austropuccinia psidii (syn. Puccinia psidii, Sphaerophragmiaceae, Pucciniales) é um fungo Basidiomiceto que alcançou uma grande ocorrência de doença conhecida como ferrugem das Mirtáceas em diversas partes do mundo, causando doença em aproximadamente em 73 gêneros e 460 espécies de Myrtaceae. No Brasil, o patógeno foi inicialmente detectado infectando goiabeiras (Psidium guajava) e posteriormente foi detectado em eucalipto (Eucalyptus grandis). Syzygium jambos também é da família das Mirtáceas, e pode ser infectado com A. psidii. Infecções por A. psidii são frequentemente observadas a partir de urediniósporos assexuados, que podem percorrer grandes distancias devido à ação do vento ou chuva. Sendo os urenidiósporos, a primeira estrutura fúngica com um qual o hospeiro tem contato, o seu perfil proteico é de suma importância para a melhor compreensão do arsenal molecular associado ao estágio inicial de infecção desse patógeno de acordo com os hospedeiros de origem. Diante disso, estudos ômicos se tornam importantes técnicas para aplicar durante o processo de infecção entre A. psidii - E. grandis, visando avaliar quais os compostos estão presentes nessa complexa interação planta-patógeno. Capítulo 1: Inicialmente foi realizado um ensaio in vitro visando avaliar a germinação de urediniósporos de MF-01 e GM-J1, provenientes de E. grandis e S. jambos respectivamente, mediante estimulo do meio ágar-água e em meio ágar-água + 0,5% de óleo mineral. A partir do estudo in vitro foi possível observar que o estimulo óleo mineral (0,5%) apresentou melhores resultados quanto à germinação dos urediniosporos, chegando a 52,6% de germinação em MF- 01 e 17,9% em GM-J1 respectivamente. Os urediniósporos MF-01 e GM-J1 também foram avaliados quanto ao perfil de proteínas visando o melhor entendimento do arsenal de proteínas inicial presentes nesta importante estrutura de infecção. Para tanto, a proteômica foi realizada por meio do espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos acoplados a um instrumento NLC de LC (MS-MS / MS) por um sistema EASY. Foi possível identificar 819 proteínas totais (incluindo comuns e exclusivas) a partir da análise de urediniósporos MF-01, sendo 74 que mais contribuíram para as diferenças de abundância; e, 798 proteínas totais (incluindo comuns e exclusivas) em urediniósporos GM-J1, sendo 65 que mais contribuíram para as diferenças de abundância. As proteínas diferencialmente abundantes foram identificadas a partir da análise VIP pelo programa Metaboanalyst. Dentre as que mais contribuíram para as diferenças de abundância, as proteínas serina / treonina-proteína fosfatase, aspartato aminotransferase e sacaropina desidrogenase merecem destaque em urediniósporos de MF-01. Enquanto proteínas como proteínas difosfomevalonato descarboxilase, GMP sintase e adenilosuccinato sintetase foram classicadas como as que mais contribuíram para as diferenças de abundância e associadas à urediniósporos de GM-J1. Essas proteínas selecionadas são importantes nos processos iniciais de infecção do patógeno em plantas suscetíveis e pertencentes às rotas metabólitas importantes, podendo ser um indicativo para a produção de uma droga antifúngica, o combate ao patógeno em estágios iniciais da doença. Capítulo 2: Urediniósporos de GM-J1 foram inoculados em plantas suscetíveis de S. jambos, folhas foram coletadas às 0, 72, 144 e 336 horas após a inoculação, e a partir daí foi realizado o monitoramento, por qPCR, do patógeno na planta. Foi possível observar que às 336 h.a.i a quantidade (pg) de DNA de GM-J1 estava maior em relação aos outros tempos amostrados. A partir da análise realizada em espectrômetro de massas Q-Tof PREMIER acoplado a um instrumento RP-nano UPLC foi realizado um estudo proteômico durante o processo de infecção (0, 144 e 336 h.a.i) de GM-J1 em plantas suscetíveis de S. jambos. Foi possível identificar 11 proteínas totais associadas à GM-J1, sendo 9 (0 h.a.i); 7 (144 h.a.i) e 6 (336 h.a.i). Destas, 3 (0 h.a.i); 3 (144 h.a.i) e 1 (336 h.a.i) foram as que mais contribuíram para as diferenças de abundância. Foi possível identificar também 118 proteínas totais associadas à S. jambos, sendo: 87 (0 h.a.i); 69 (144 h.a.i) e 63 (336 h.a.i). Destas, 36 (0 h.a.i); 11 (144 h.a.i) e 11 (336 h.a.i) foram as que mais contribuíram para as diferenças de abundância. As proteínas que mais contribuíram para as diferenças de abundância foram identificadas a partir da análise VIP. Como destaque em cada tempo avaliado, em relação à função da proteína associada a GM-J1, foi possível observar que a proteína glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (0 h.a.i), pode ter um papel importante para a germinação de urediniósporos; glycine dehydrogenase e heat shock protein SSB (144 h.a.i), associados ao crescimento do micélio e patogeniciade; e heat shock protein 60 (336 h.a.i), envolvida em ações relacionada à colonização, infecção e patogenicidade do fungo. Foram também identificadas proteínas importantes no processo de defesa da planta contra o ataque do patógeno: photosystem II protein D2 e photosystem I reaction center subunit III (0 h.a.i); pathogenesis-related protein STH-2-like e translationally-controlled tumor protein homolog (144 h.a.i); major allergen Pru ar 1 e plastocyanin (336 h.a.i). Estes resultados podem indicar que a partir das proteínas encontradas no estudo podemos ter um melhor entendimento acerca do que ocorre durante o processo de infecção na interação A. psidii - S. jambos. Capítulo 3: Foi realizado a análise metabolômica por meio de Cromatografia Líquida (LC-MS; nos modos negativo e positivo de operação) e Cromatografia Gasosa (GC-MS), aliados a uma análise proteômica realizada com o auxílio de espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos acoplados a um instrumento NLC de LC (MS-MS / MS) por um sistema EASY. Estas análises foram realizadas durante o início e final do processo de infecção de A. psidii em E. grandis, sendo coletado material vegetal inoculado com o patógeno às 0 e 144 horas após a inoculação (h.a.i.). Como resultados foram identificadas 2299 proteínas totais durante a interação planta patógeno. Onde 143 estão associadas a funções de A. psidii e 2156 relacionadas à E. grandis. Dentre as proteínas associadas à A. psidii destacam-se: Fungal Zn binuclear cluster domain conteining protein (0 h.a.i) - associada à formação de apressório; transaldolase (144 h.a.i) e adenosylhomocysteinase (144 h.a.i) - estas associadas ao metabolismo, patogenicidade e colonização no hospedeiro. Em relação as proteínas identificadas em E. grandis, as proteínas que possuem funções interessantes são: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase e rubisco accumulation factor 1 identificadas às 0 h.a.i (participando na produção de energia - fotossíntese); e as proteínas malate dehydrogenase, major allergen Pru av 1-like, abscisic stress ripening protein, actin-7, V-type proton ATPase, proteasome subunit alpha e isoflavone reductase-like identificadas às 144 h.a.i (com funções relacionada à defesa da planta). De acordo com os resultados obtidos a partir das análises metabolômicas foi possível observar que 59 metabólitos foram identificados a partir de LC-MS (50 no modo positivo de operação - 16 às 0 h.a.i e 34 às 144 h.a.i; e 9 no modo negativo de operação - 4 às 0 h.a.i e 5 às 144 h.a.i) e 32 a partir do estudo de GC-MS (com 7 às 0 h.a.i; 24 às 144 h.a.i e 1 presente em ambos os tempos analisados). A partir da análise LC-MS (modo positivo) a oleacin (0 h.a.i) pode estar auxiliando o processo de germinação do fungo. Enquanto a ceramide (144 h.a.i) atua no processo de defesa da planta. Na LC-MS (modo negativo de operação) os metabólitos 6-Hydroxy-3,3\',4\',5,7,8- hexamethoxyflavone (0 h.a.i) e Chlorhexidine (144 h.a.i) foram encontrados e podem participar do mecanismo de defesa da planta. Como metabólitos importantes na interação patógeno-planta provenientes de GC-MS, o ácido cinâmico (encontrado as 0 h.a.i) pode auxiliar o fungo no processo de entrada nos tecidos da planta; e os metabólitos Calistegina A3, ácido azeláico, ácido glicérico e piridoxamina (encontrados às 144 h.a.i) estão associados ao processo de defesa da planta. Diversas proteínas e metabólitos identificados no presente estudo possuem funções relacionadas ao sistema de defesa da planta ou ao mecanismo de ataque desenvolvido pelo fungo. Há uma correlação entre as proteínas XP_010028896.1 (eukaryotic peptide chain release factor subunit 1-3), XP_010056880.1 (urease accessory protein G), XP_010062321.1 (expansin-A13), XP_010066331.1 (ubiquitin domain-containing protein DSK2a isoform X1), XP_010044210.1 (phosphoglucomutase cytoplasmic isoform X2), XP_010038186.1 (glutathione S-transferase F13) identificadas em E. grandis com a proteína evm.model.NODE_10888_length_9735_cov_3.75075.1 (ADP-ribosylation fator) encontrada no estudo proteômico em A. psidii. Neste sentido, os resultados obtidos contribuem com o melhor entendimento à nível molecular da interação entre A. psidii e E. grandis, servindo como base para futuros estudos. Desta forma, foi possível observar que estudos proteômicos e metabolômicos são de grande importância para um melhor entendimento da doença causada por A. psidii em plantas de E. grandis e S. jambos.