Análise genética de pacientes portadores de cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) e caracterização funcional em cardiomiócitos diferenciados (hiPSC-CM)

• Autor(a) principal: Wulkan, Fanny
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5166/tde-07082019-104943/
• topic: Arrhythmogenic right ventricular dysplasia; Cardiomiopatias; Cardiomyopathies; Cellular reprogramming; Células-tronco pluripotentes induzidas; Displasia arritmogênica ventricular direita; Genética médica; Genetics medical; High-throughput nucleotide sequencing; Induced pluripotent stem cells; Miócitos cardíacos; Mutação; Mutation; Myocytes cardiac; Reprogramação celular; Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala

A cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito (CAVD) tem origem genética e é caracterizada pela substituição de células miocárdicas por tecido fibroadiposo. A doença tem uma prevalência aproximada de 1:3500, sendo mais frequentemente diagnosticada em indivíduos jovens, atletas e do sexo masculino. Atualmente, várias alterações genéticas associadas a CAVD foram descritas em 12 genes diferentes. No entanto, existem poucos estudos na literatura que descrevem o espectro mutacional da doença usando um painel abrangente de genes potencialmente causais, em populações diferentes das coortes descendentes de europeus. O sequenciamento de nova geração (NGS) como ferramenta para o diagnóstico molecular da doença, permite um avanço na correlação entre alterações genotípicas e fenotípicas e tem aportado potenciais benefícios que crescem juntamente com os desafios na sua interpretação. Além disso, o uso de hiPSCs como modelo in vitro de determinadas doenças cardíacas, permite avaliar especificamente a relação do genótipo com as diferentes consequências fenotípicas celulares da CAVD. Entretanto, os mecanismos moleculares da doença ainda são pouco esclarecidos e não há na literatura estudos que englobem ao mesmo tempo o perfil mutacional (com um painel extenso de genes) e estudo funcional das alterações encontradas com o uso de hiPSC-CMs. Esta tese teve como objetivo descrever a prevalência de variantes causais em genes associados à CAVD na população brasileira, e caracterizar, do ponto de vista funcional, os cardiomiócitos derivados de hiPSC (hiPSC-CMs) de pacientes com mutações identificadas, a fim de associar o perfil mutacional e a expressão fenotípica celular. Quarenta e sete indivíduos, não aparentados, sendo 38 (80,85%) pacientes do sexo masculino, idade média 40,2 ± 15,56 anos, com diagnóstico clínico de CAVD, foram submetidos ao sequenciamento de um painel genético relacionado à cardiomiopatias hereditárias, compreendendo os 12 genes previamente descritos como causadores de CAVD, utilizando sequenciamento de nova geração (NGS). As variantes foram interpretadas e classificadas de acordo com os critérios da ACMG. Variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas foram encontradas em dezoito probandos (38,3%), com maior número de ocorrências no gene PKP2 (38,8%). Entre os 18 casos positivos, treze variantes diferentes foram encontradas, quatro delas novas variantes em genes desmossomais, sem descrição prévia na literatura. Variantes de significado incerto (VSI) foram encontradas em 16 pacientes. A presença de uma variante causal ocorreu em todos os probandos assintomáticos e foi significativamente associada a probandos com histórico familiar de morte súbita cardíaca abaixo de 35 anos. Para a modelagem celular da CAVD, foram geradas hiPSCs de dois pacientes a partir de células progenitoras de urina (UPCs) e fibroblastos, por transfecção episomal. O primeiro paciente possuía alteração missense no gene PKP2 e o segundo, uma inserção no gene DSC2. As hiPSCs foram caracterizadas quanto ao seu potencial de pluripotência e posteriormente diferenciadas em cardiomiócitos (hiPSC-CMs). Nossos resultados demonstraram diferenças fenotípicas significativas entre os CAVD-CMs comparados com os controle-CMs, como: reduções significativas de expressão das proteínas desmossomais e desmossomos estruturalmente alterados; presença de marcadores do acúmulo de gotículas lipídicas e regulação aumentada do fator de transcrição proadipogênico PPAR-gama; aumento de duração do potencial de campo (FPD) e do potencial de ação em 90% de repolarização (APD90); velocidade de condução mais lenta e uma força de contração menor. Em conclusão, este é o primeiro trabalho a caracterizar o perfil genético da CAVD, abrangendo todos os genes descritos até o momento relacionados à doença, na população brasileira. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que, pacientes com história familiar de MSC ( < 35 anos) têm maior probabilidade de portar uma variante causal. Além disso, nossos achados sugerem que pacientes com alteração causal no gene PKP2 têm uma maior gravidade da apresentação fenotípica de arritmia. Nosso modelo celular, que contemplou células paciente-específicas com diferentes alterações das estudadas até o presente momento,sugere ser possível o estudo do efeito das alterações genéticas na CAVD e pode ser um acréscimo às ferramentas disponíveis para estudar o mecanismo desta doença complexa