Estudo sobre o tráfego intracelular de Env do HIV-1 e a manutenção da infecciosidade viral

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pereira, Estela Aparecida
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-02082024-084534/
Resumo: O complexo de envelope do HIV (Env) é composto por uma glicoproteína de superfície (gp120) ancorada a uma glicoproteína transmembrana (gp41), as quais são responsáveis pela entrada do vírus na célula hospedeira. Env é sintetizado pela via biossintética celular, mas suas rotas de transporte até sua correta incorporação nos virions recém-sintetizados ainda não está bem estabelecida. Trabalhos anteriores apresentaram evidências divergentes sobre possíveis funções dos complexos adaptadores APs (do inglês, adaptor proteins) de vesículas de clatrina e de sinais de direcionamento na cauda citosólica de gp41(CT) no tráfego de Env. Para entender a relevância do tráfego vesicular no transporte intracelular das glicoproteínas do HIV, a distribuição subcelular de Env foi analisada por microscopia confocal. Em condições normais, gp41 colocaliza-se principalmente com marcadores de endossomos tardios. Tal distribuição sugeriu que o tráfego intracelular de moléculas de Env recém-sintetizadas deve ser altamente regulado ao invés de ocorrer por via constitutiva. Por citometria de fluxo e microscopia confocal, observamos que a GTPase Arf1, cuja atividade é importante para a exportação de proteínas a partir da rede trans-Golgi (TGN), foi fundamental para o direcionamento de Env para os endossomos. Ainda, partículas de HIV-1, produzidas em células superexpressando um dominante negativo da GTPase, incorporaram menos Env e se tornaram menos infecciosas. Arf1 está associada a vesículas de clatrina reguladas por proteínas adaptadoras: AP-1, AP-3, AP-4 ou GGAs. A partir de ensaios pelo sistema de duplo híbrido em leveduras, identificou-se a interação de 41CT com a subunidade µ1A de AP-1, adaptador que controla o transporte de cargas entre TGN e endossomos. Por mutagênese sítio-dirigida, foram definidos ainda o sinal de direcionamento em gp41 e o sítios de ligação em µ1A necessário para esta interação. Por fim, observou-se que AP-1 também é importante para o ciclo replicativo do vírus, afetando de forma indireta a capacidade infecciosa de vírus gerados em células silenciadas para este adaptador. Juntos, os resultados sugerem que vesículas de clatrina reguladas por Arf1 e AP-1 estão envolvidas no direcionamento de Env para os sítios de montagem do vírus, sendo uma nova peça que compõe um mecanismo essencial para o controle da incorporação de Env durante a síntese do envelope viral e garante a propagação viral.
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Para entender a relevância do tráfego vesicular no transporte intracelular das glicoproteínas do HIV, a distribuição subcelular de Env foi analisada por microscopia confocal. Em condições normais, gp41 colocaliza-se principalmente com marcadores de endossomos tardios. Tal distribuição sugeriu que o tráfego intracelular de moléculas de Env recém-sintetizadas deve ser altamente regulado ao invés de ocorrer por via constitutiva. Por citometria de fluxo e microscopia confocal, observamos que a GTPase Arf1, cuja atividade é importante para a exportação de proteínas a partir da rede trans-Golgi (TGN), foi fundamental para o direcionamento de Env para os endossomos. Ainda, partículas de HIV-1, produzidas em células superexpressando um dominante negativo da GTPase, incorporaram menos Env e se tornaram menos infecciosas. Arf1 está associada a vesículas de clatrina reguladas por proteínas adaptadoras: AP-1, AP-3, AP-4 ou GGAs. A partir de ensaios pelo sistema de duplo híbrido em leveduras, identificou-se a interação de 41CT com a subunidade µ1A de AP-1, adaptador que controla o transporte de cargas entre TGN e endossomos. Por mutagênese sítio-dirigida, foram definidos ainda o sinal de direcionamento em gp41 e o sítios de ligação em µ1A necessário para esta interação. Por fim, observou-se que AP-1 também é importante para o ciclo replicativo do vírus, afetando de forma indireta a capacidade infecciosa de vírus gerados em células silenciadas para este adaptador. Juntos, os resultados sugerem que vesículas de clatrina reguladas por Arf1 e AP-1 estão envolvidas no direcionamento de Env para os sítios de montagem do vírus, sendo uma nova peça que compõe um mecanismo essencial para o controle da incorporação de Env durante a síntese do envelope viral e garante a propagação viral.HIV-1 Env consists of the surface glycoprotein gp120 and the transmembrane glycoprotein gp41, and mediates entry of the virus into host cells. Env is synthesized in the biosynthetic pathway, but the transport routes for the proper incorporation into newly-synthesized virions remain incompletely understood. Previous work presented conflicting evidences on possible roles of the adaptor protein (AP) complexes of clathrin-coated vesicles, and gp41 cytosolic tail (CT) sorting signals on Env trafficking. To understand the relevance of the vesicle trafficking system in the intracellular transport of the HIV-1 glycoproteins, we analyzed the subcellular distribution of Env by confocal microscopy. In steady-state conditions, gp41 mostly co-localizes with markers of late endosomes. Such observation suggested us a highly controlled trafficking of newly-synthesized Env, instead of following the constitutive secretory pathway. By flow citometry and confocal microscopy, we observed the importance of the GTPase Arf1, which is related to cargo exportation from the trans-Golgi network (TGN), for the trafficking of Env to endosomes. Moreover, HIV-1 particles, synthesized in cells expressing a dominant negative version of this GTPase, presented less Env incorporated and reduced virus infectivity. Arf1 is associated to clathrin-coated vesicles regulated by adaptor proteins: AP-1, AP-3, AP-4 or GGAs. Using a yeast two-hybrid system approach, we analyzed different adaptor proteins of clathrin-coated vesicles and identified that gp41CT interacts with the µ1A subunit of AP-1, an adaptor that controls transport of cargo between the TGN and endosomes. By site-directed mutagenesis, we also defined the sorting motif in gp41 and the binding domain in µ1A required for this interaction. Finally, we noticed that AP-1 is also important to the virus replicative cycle, as the produced viruses became less infective under synthesis in AP-1 defective cells. Together, our results suggest clathrin vesicles regulated by Arf1 and AP-1 are involved in the targeting of Env to the virus assembly sites, and they represent a new piece of the essential mechanism that controls the incorporation of Env during the viral envelope synthesis and ensures the HIV-1 spreading.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPSilva, Luis Lamberti Pinto daPereira, Estela Aparecida2019-07-05info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-02082024-084534/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2024-08-05T19:06:03Zoai:teses.usp.br:tde-02082024-084534Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212024-08-05T19:06:03Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
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