Desenvolvimento de imunoensaios e biossensores para determinação de LDL eletronegativa

• Autor(a) principal: Faulin, Tanize Espirito Santo
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-21012011-150659/
• topic: Antibodies; Anticorpos; Aterosclerose; Atherosclerosis; ELISA; ELISA; Nanoparticles; Nanopartículas; Validação; Validation

A lipoproteína de baixa densidade eletronegativa (LDL-) é um importante antígeno envolvido na patogênese da aterosclerose. A LDL(-) provoca resposta inflamatória e imunológica, levando à produção de autoanticorpos anti-LDL(-) e a formação subsequente de imunocomplexos (IC-LDL-), os quais também contribuem com o processo aterosclerótico. Diante disso, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de imunoensaios para quantificação plasmática de LDL(-), anti-LDL(-) e IC-LDL(-), assim como o desenvolvimento de ferramentas aplicáveis em um biossensor para LDL(-). Após a padronização de cada ELISA, foram avaliadas as características de desempenho dos métodos: limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão intra e inter-ensaios, exatidão, linearidade de diluição e interferentes. Os LD e LQ do ELISA para LDL(-) foram 0,423 mg/L e 0,517 mg/L de LDL(-), respectivamente. As concentrações plasmáticas de LDL(-) apresentaram linearidade quando os plasmas foram diluídos 1:1000, 1:2000, 1:4000 e 1:8000. Os LD e LQ do ELISA para anti-LDL(-) foram 0,0028 mg/L e 0,0032 mg/L de anti-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade na diluição quando diluídos 1:100, 1:200, 1:400 e 1:800. Os LD e LQ do ELISA para IC-LDL(-) foram 0,023 g/L e 0,034 g/L de IC-LDL(-), respectivamente. Os plasmas apresentaram linearidade quando diluídos 1:12,5, 1:25, 1:50 e 1:100. Os três ELISAs apresentaram precisão intra e inter-ensaios e recuperação dentro dos limites requeridos para imunoensaios. Para o desenvolvimento de um biossensor para LDL(-), uma proteína recombinante, denominada GFP5-scFv, foi expressa em bactérias Escherichia coli da linhagem BL21(DE3). Para obtenção dessa proteína foi realizada a inserção da sequência de DNA de um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-LDL(-) em um vetor bacteriano com a sequência de DNA da proteína verde fluorescente (GFP5). Dessa forma, a GFP5-scFv é fluorescente e tem afinidade pela LDL(-). Também foram sintetizadas nanopartículas de ouro, as quais podem ser eficientemente utilizadas na supressão da emissão da fluorescência de GFP5-scFv. Portanto, os imunoensaios validados e os aplicativos desenvolvidos para o biossensor são ferramentas que tem potencial para serem utilizadas na avaliação da patogênese da aterosclerose.