Efeito de inibidores de endonucleases na transferência gênica mediada por espermatozoides em camundongos

• Autor(a) principal: Maria, Fernanda Sevciuc
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10131/tde-23042013-103122/
• topic: Animal transgenesis; ATA; ATA; COMET assay; COMETA alcalino; PCR em tempo real; PCX-EGFP; PCX-EGFP; Real time PCR; Transgenia animal

A baixa eficiência e a dificuldade de reprodução de resultados da técnica de transferência gênica mediada por espermatozoides (TGME) têm como possível explicação à ativação de endonucleases espermáticas. Assim, a inibição desta enzima poderia evitar a fragmentação de DNA (exógeno e genômico), possibilitando assim, o uso de maiores concentrações de DNA exógeno, aumentando a eficiência e garantindo a reprodutibilidade da técnica. O ácido aurintricarboxílico (ATA) é um inibidor geral de endonucleases (HALLICK et al., 1977), inclusive das endonucleases espermáticas (MAIONE et al., 1997; MAGNANO et al., 1998). Deste modo, o presente estudo objetivou avaliar a inibição das endonucleases espermáticas, pelo ácido aurintricarboxílico (ATA). Para isso, três experimentos foram realizados: 1) avaliar a inibição das endonucleases espermáticas pela adição do ácido aurintricarboxílico, após incubação com DNA exógeno; 2) verificar a eficiência do ATA na inibição de fragmentação de DNA genômico e 3) detectar o aumento nos índices de internalização após o uso de ATA. Para o primeiro experimento, um ensaio de digestão plasmidial com os plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3 e três concentrações de ATA (10µM, 25µM e 50µM) foram testados. As digestões dos vetores plasmidiais ocorreram pela incubação dos plasmídeos PCX-EGFP e pmGENIE3, com e sem a presença de ATA, com extratos espermáticos. As incubações ocorreram durante 1 hora à 37ºC e os produtos foram analisados por eletroforese (2 horas, 100mV) em gel de agarose 0,7%. Os resultados foram avaliados em escala de cruzes, no qual 1 foi considerado digestão total dos plasmídeos e 3, a não digestão. Os resultados foram analisados em nível de significância de 5%. Os resultados demonstraram diferenças nas digestões dos dois vetores plasmidiais, sendo o pmGENIE3 mais susceptível à degradação pelo extrato espermático, demonstrando ausência de bandas em algumas replicatas (mediana=1). O PCX-EGFP apresentou inibição parcial da degradação já com 10µM de ATA. Já o pmGENIE só apresentou inibição da degradação com 25 ou 50µM de ATA. Assim a concentração utilizada nos experimentos consecutivos foi a de 50µM. Para o experimento 2, espermatozoides de camundongos da linhagem Bl-6/DBA (F1) foram incubados com duas concentrações (500 ou 1000ng) do plasmídeo PCX-EGFP, com ou sem pré-incubação com ATA. As incubações ocorreram durante 5 horas, em ar com 5% de CO2 à 37ºC. Assim, os espermatozoides foram submetidos ao teste de susceptibilidade à denaturação ácida e ao ensaio de cometa alcalino para verificar possível fragilidade da cromatina. Os dados demonstraram que o uso do ATA em espermatozoides murinos leva à fragilidade do genoma, independente de serem incubados com DNA exógeno e a concentração do mesmo. Além disso, foi possível verificar que pode existir um limiar de concentração ótima para que as endonucleases causem fragmentação do DNA cromossomal, o qual foi de 500ng. O uso de concentrações maiores, como 1000ng, pode ter agido como fator protetor ao DNA genômico, podendo este DNA exógeno ter sido o alvo primário das endonucleases, já que quando as amostras foram incubadas com essa concentração de plasmídeo, não houve altos índices de fragmentação no DNA endógeno. No experimento 3, espermatozoides de camundongos foram incubados com 500 ou 1000ng de PCX-EGFP/106 células, sendo ou não pré-incubados com ATA. O DNA genômico das células espermáticas foi extraído pelo método de fenol clorofórmio, diluído para concentração de 1ng/µl e submetidos à quantificação de DNA plasmidial pela técnica de quantificação absoluta em tempo real (qPCR). Os resultados demonstraram que o ATA não melhorou a eficiência de incorporação, já que tanto na concentração de 500 quanto na de 1000ng de DNA exógeno, a porcentagem foi menor (0,001% para os dois grupos) em relação aos grupos nos quais este não foi utilizado. Os grupos em que o ATA não foi utilizado não apresentaram diferença entre si demonstrando que a quantidade de 500ng de DNA exógeno foi suficiente na internalização deste ao espermatozoide, sendo a porcentagem de incorporação maior do que 1000ng (0,20% contra 0,10%). Contudo, o uso do inibidor de endonucleases, ao invés de aumentar os índices de incorporação apresentou resultados opostos, indicando que seu uso não trouxe melhorias para a técnica de TGME.