Mecanismos moleculares envolvidos na transição entre o estado primed e naïve de células-tronco embrionárias

• Autor(a) principal: Corveloni, Amanda Cristina
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-03112020-115800/
• topic: Células-tronco embrionárias; Embryonic stem cells; Naïve; Naïve; Notch; Notch; Pluripotência; Pluripotency; Primed; Primed

Células-tronco embrionárias (CTE) pluripotentes são definidas como células com potencial de diferenciação para os três folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma e endoderma). CTE pluripotentes de camundongos (mESCs) são consideradas possuidoras de um estado de pluripotência \"naïve\", definida pela habilidade de se auto-renovar, mantendo o potencial de diferenciação (sem tendências), enquanto as células do epiblasto (EpiSCs) formado após a implantação sofrem mudanças marcantes, tornando-se preparadas (primed) para responder a sinais indutores de diferenciação. As CTE humanas (hESCs) são consideradas, com base em características transcricionais, morfológicas e de dependência de vias de sinalização, mais próximas das EpiSCs de camundongo do que das mESCs, compreendidas como no estado primed. Nosso grupo mostrou recentemente que o miR-363 promove a pluripotência em hESCs por inibição pós-transcricional de componentes da sinalização de Notch. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da via de sinalização Notch no contexto dos estados naïve e primed de pluripotência em hESCs. Para isso foram utilizadas as linhagens de CTEh H1 e H9, e foram explorados diversos métodos de conversão do estado primed para naïve in vitro, com inibidores (LIF-5i/3i) com dois meios distintos e com meio comercial RSeT(TM) em condições de hipóxia e normóxia, além da inibição da sinalização de Notch com um inibidor da gama-secretase (DAPT). Foram avaliados parâmetros característicos de cada estado (marcadores de superfície e genes associados aos estados primed e naïve) por microscopia de imunofluorescência quantitativa (High Content Analysis/Microscopy), citometria de fluxo e expressão gênica. As alterações sobre esses marcadores variaram de acordo com o método de conversão utilizado, porém as alterações mais marcantes foram o aumento dos transcritos de DPPA3 e KLF4, importantes genes associados ao estado naïve, efeito também provocado pela inibição a sinalização de Notch em diferentes abordagens avaliadas. Adicionalmente ainda foi observado um aumento do transcrito de DNMT3L (também importante marcador naïve) e a diminuição da marcação de H3K27me3 nas condições de cultura naïve assim como com a inibição da sinalização de Notch. Nossos dados demonstram que inibição da sinalização de Notch regula positivamente a rede transcricional relacionada ao estado naïve, além de possivelmente estar relacionado a uma modulação epigenética, sustentando nossa hipótese que a sinalização de Notch está envolvida no processo de transição primed/naïve, no entanto o mecanismo por qual atua ainda não totalmente elucidado. Demonstramos, ainda, que a associação de uma droga inibidora da sinalização de Notch pode ser explorada como um método mais eficaz para o processo de transição primed/naïve in vitro.