Caracterização molecular de isolados do vírus Varicela Zoster em amostras de líquido cefalorraquidiano de pacientes com quadro de meningite, encefalite ou meningoencefalite aguda

• Autor(a) principal: Paião, Heuder Gustavo Oliveira
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5134/tde-20092023-123627/
• topic: Central nervous system; Epidemiologia molecular; Herpesvirus 3 human; Herpesvírus humano 3; Massive parallel sequencing; Molecular epidemiology; Reação em cadeia da polimerase em tempo real; Real-time polymerase chain reaction; Sequenciamento massivo paralelo; Sistema nervoso central

Introdução: O vírus varicela zoster (VZV) é classificado como herpes vírus humano do tipo 3 (HHV-3). Seu genoma de DNA dupla fita possui 125 pb. Atualmente são descritos nove clados de VZV. É agente causador da varicela e, em caso de reativação, do herpes zoster. As complicações mais graves, em ambas situações clínicas, são associadas ao envolvimento do sistema nervoso central (SNC), entre eles os quadros agudos de meningite, encefalite e/ou meningoencefalite (MEM). A dificuldade de acesso a técnicas laboratoriais sensíveis na rede pública de saúde constitui fator limitante para a caracterização diagnóstica, da prevalência e da epidemiologia molecular do VZV em nosso meio. Desta forma, são escassos os estudos a este respeito no Brasil, a despeito de sua importância para o cenário de saúde pública global e local. Objetivos: 1- Avaliar o desempenho de um teste de PCR em tempo real in-house e validá-lo para a sua aplicação na detecção do DNA de VZV em LCR; 2- Caracterizar os isolados de VZV identificados para discriminação da presença do vírus vacinal ou vírus selvagem; 3- Caracterizar os isolados identificados para a classificação filogenética de seus clados. Material e Métodos: As amostras analisadas neste estudo são parte de um projeto maior que incluiu 600 casos de MEM aguda da cidade de São Paulo, Brazil, coletados entre fevereiro de 2018 e dezembro de 2019. Para validar e avaliar a sensibilidade analítica e desempenho do teste in-house, um painel de controles de VZV no LCR previamente testados por plataformas diagnósticas de referência e controles sintéticos com concentração conhecida foram usados. Para a discriminação da presença do vírus selvagem ou vacinal, a metodologia utilizada baseou-se na detecção de um SNP na região 107252 do genoma do VZV, por PCR em tempo real. Para classificação filogenética dos clados, utilizou-se amplificação das sequências de DNA de VZV de quatro ORFs do genoma viral, a saber: 22, 38, 54 e 62, pelo método de Sanger (MS) e complementarmente utilizou-se o método de sequenciamento massivo paralelo (SMP). Resultados: Dentre todas as amostras analisadas foram identificados 30 casos de MEM por VZV, 5% (30/600) dos casos incluídos no projeto inicial. O desempenho do teste in-house para VZV foi satisfatório e sua sensibilidade analítica foi < 5 cópias por reação. Casos de VZV de origem vacinal não foram identificados. Em 40% (12/30) das amostras analisadas, foi possível a identificação dos clados envolvidos, a saber: clado 1 (5/12), clado 2 (3/12), clado 3 (1/12), clado 5 (2/12) e clado 6 (1/12) pelo MS. O método de SMP adaptado foi responsável pela identificação de apenas um único isolado de VZV entre todas as amostras disponíveis (28). Por SMP identificamos amostras sugestivas da presença de coinfecção com outros patógenos. Conclusões: O teste de PCR em tempo real in-house desenvolvido apresentou desempenho satisfatório em termos de eficiência e sensibilidade analítica, constituindo-se assim uma ferramenta diagnóstica adequada para a identificação do VZV em amostras de LCR, em locais de menor acesso às plataformas comerciais já disponíveis. Nas amostras analisadas não fomos capazes de identificar a presença de vírus vacinal e conseguimos identificar a presença do clado 2, pela primeira vez na América Latina e do clado 6, pela primeira vez em nosso país. O método de SMP adaptado não atendeu às expectativas de complementação na caracterização molecular em relação ao MS nas amostras analisadas