Identificação de RNAs longos não-codificadores de proteínas regulados por micro-RNAs

• Autor(a) principal: Amaral, Murilo Sena
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22102014-102412/
• topic: Expressão gênica; Gene expression; Long non-coding RNAs; Micro-RNAs; Micro-RNAs; RNA-Seq fita-específico; RNAs longos não-codificadores; Strand-specific RNA-Seq

Estudos recentes têm revelado que a maior parte dos transcritos gerados em células humanas é composta por RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs). Uma parte desses ncRNAs compreende a classe de RNAs curtos, que possuem menos que 200 nucleotídeos. Os micro-RNAs (miRNAs) fazem parte dessa classe e têm sido alvo de grande interesse, pois são preditos como possíveis reguladores de mais de 60% dos RNAs mensageiros (mRNAs) humanos. Outra classe dos ncRNAs é composta por ncRNAs longos (lncRNAs, com mais de 200 nucleotídeos), que são transcritos a partir de regiões intergênicas e intrônicas do genoma humano e possuem várias funções, muitas delas relacionadas ao controle da expressão de mRNAs. Recentemente, os lncRNAs têm sido caracterizados quanto à sua estrutura e função. No entanto, muito pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais os lncRNAs são regulados. Este trabalho teve como objetivo avaliar se lncRNAs são regulados por miRNAs em células humanas. Para tanto, identificamos lncRNAs ligados ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) em células da linhagem HeLa, utilizando um método aqui desenvolvido de geração de bibliotecas de cDNA direcionadas para sequenciamento em larga escala na plataforma 454/Roche. Em paralelo, sequenciamos os miRNAs ligados ao RISC nestas mesmas células. Os resultados obtidos mostram que centenas de lncRNAs de diversas classes se ligam ao RISC em células HeLa, juntamente com milhares de mRNAs e várias centenas de miRNAs. Entre os miRNAs, encontramos 37 que são preditos como alvejando os lncRNAs detectados. Estes miRNAs constituem possíveis reguladores dos lncRNAs e, portanto, nosso trabalho estabelece um mapa experimental de interações diretas entre lncRNAs e miRNAs. Dentre os lncRNAs identificados ligados ao RISC neste trabalho, destaca-se o TUG1, lincRNA sabidamente envolvido na regulação de genes relacionados à apoptose e ao ciclo celular. Mostramos por ensaio de super-expressão de miRNAs e qPCR que TUG1 é regulado pelo miRNA-148b, um dos miRNAs por nós detectados que possui um sítio alvo altamente conservado em mamíferos localizado na extremidade 3\' de TUG1. Em conjunto, este trabalho contribui para o entendimento da regulação dos níveis de expressão de lncRNAs em células humanas e abre perspectivas para a modulação de miRNAs como estratégia de regulação dos níveis e das funções de lncRNAs.