Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial
Autor(a) principal: | |
---|---|
Data de Publicação: | 2023 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
Texto Completo: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/ |
Resumo: | A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma das principais causas de doenças cardiovasculares, sendo causado principalmente por variantes genéticas no gene do Receptor de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDLR). Apesar das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) serem capazes de identificar diversas variantes, poucas delas foram funcionalmente caracterizadas. A utilização da ferramenta de edição gênica CRISP/Cas9 promove uma edição gênica precisa e permite a criação de modelos experimentais, de forma a contribuir para a melhor validação funcional dessas variantes. O objetivo deste trabalho foi realizar a avaliação funcional de variantes do LDLR identificadas em portadores de HF, através da utilização de CRISPR/Cas9.: Baseado em análises de predição in sílico, do domínio afetado da proteína e na frequência da variante na população, selecionou-se três variantes do LDLR (rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln; rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu e rs879254797 c.1118G>A p.Gly373Asp), e construiu-se três sgRNAs para cada um deles. Os sgRNAs foram inseridos no plasmídeo PX458 previamente digerido com a enzima de restrição BbsI, clonados e purificados em bactérias E. coli DH5α, e co-transfectados com os seus respectivos moldes de reparo de DNA em células HepG2. As células co-transfectadas foram isoladas por FACS, e colocadas em cultura para crescimento e posterior avaliação funcional. A expressão de LDLR foi avaliada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR conjugado com Alexa Fluor-647, e por Western Blotting. A análise de atividade do LDLR foi realizada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR e Dil-LDL. Realizou-se também análises de microscopia confocal e por microscopia em campo claro utilizando-se marcação com Oil Red O para avaliação da atividade das células cotransfectadas. As variantes foram também analisadas por docking molecular para avaliar o efeito das variantes. Análises funcionais das células HepG2 editadas revelaram menores índices tanto de expressão quanto de ligação a partícula de LDL e internalização do complexo LDLR-LDL, para as três variantes estudadas. A análise de docking molecular para a variante rs879254797 revelou que a troca de um Asp por um Gly na posição 373 diminui a distância de interação entre o LDLR e a ApoB, aumentando a força de interação do complexo e diminuindo o processo de reciclagem do receptor de volta para a membrana. Além disso, verificou-se por microscopia, a ocorrência de processos celulares como comunicação célula-célula e formação de pseudópodes para captura de LDL nas células co-transfectadas com essa variante. Para a variantes rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu, além da menor expressão, ligação e internalização do complexo LDLR-LDL, observouse também a formação de vacuolização e deposição de lipídeos. Conclui-se com este estudo que, apesar das variantes rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln e rs750518671 c.2389G>C p.Val797Leu terem sido associadas a alterações no processo de ancoramento do receptor a membrana, os resultados9 demonstraram que estas variantes também apresentam efeito patogênico devido aos baixos níveis de expressão, de ligação à LDL e de internalização do complexo LDLR-LDL, que foram refletidos nos fenótipos dos pacientes. |
id |
USP_f33f0c15457c0da2efe93a28f04c9081 |
---|---|
oai_identifier_str |
oai:teses.usp.br:tde-12122023-113730 |
network_acronym_str |
USP |
network_name_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
repository_id_str |
2721 |
spelling |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familialConstruction of an in vitro models based on CRISPR/Cas9 gene editing aiming to enhance the understanding of genetic influence on Familial HypercholesterolemiaCRISPRCRISPR/Cas9Familial HypercholesterolemiaFunctional AnalysesHipercolesterolemia FamilialLDLRLDLRA Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma das principais causas de doenças cardiovasculares, sendo causado principalmente por variantes genéticas no gene do Receptor de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDLR). Apesar das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) serem capazes de identificar diversas variantes, poucas delas foram funcionalmente caracterizadas. A utilização da ferramenta de edição gênica CRISP/Cas9 promove uma edição gênica precisa e permite a criação de modelos experimentais, de forma a contribuir para a melhor validação funcional dessas variantes. O objetivo deste trabalho foi realizar a avaliação funcional de variantes do LDLR identificadas em portadores de HF, através da utilização de CRISPR/Cas9.: Baseado em análises de predição in sílico, do domínio afetado da proteína e na frequência da variante na população, selecionou-se três variantes do LDLR (rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln; rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu e rs879254797 c.1118G>A p.Gly373Asp), e construiu-se três sgRNAs para cada um deles. Os sgRNAs foram inseridos no plasmídeo PX458 previamente digerido com a enzima de restrição BbsI, clonados e purificados em bactérias E. coli DH5α, e co-transfectados com os seus respectivos moldes de reparo de DNA em células HepG2. As células co-transfectadas foram isoladas por FACS, e colocadas em cultura para crescimento e posterior avaliação funcional. A expressão de LDLR foi avaliada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR conjugado com Alexa Fluor-647, e por Western Blotting. A análise de atividade do LDLR foi realizada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR e Dil-LDL. Realizou-se também análises de microscopia confocal e por microscopia em campo claro utilizando-se marcação com Oil Red O para avaliação da atividade das células cotransfectadas. As variantes foram também analisadas por docking molecular para avaliar o efeito das variantes. Análises funcionais das células HepG2 editadas revelaram menores índices tanto de expressão quanto de ligação a partícula de LDL e internalização do complexo LDLR-LDL, para as três variantes estudadas. A análise de docking molecular para a variante rs879254797 revelou que a troca de um Asp por um Gly na posição 373 diminui a distância de interação entre o LDLR e a ApoB, aumentando a força de interação do complexo e diminuindo o processo de reciclagem do receptor de volta para a membrana. Além disso, verificou-se por microscopia, a ocorrência de processos celulares como comunicação célula-célula e formação de pseudópodes para captura de LDL nas células co-transfectadas com essa variante. Para a variantes rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu, além da menor expressão, ligação e internalização do complexo LDLR-LDL, observouse também a formação de vacuolização e deposição de lipídeos. Conclui-se com este estudo que, apesar das variantes rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln e rs750518671 c.2389G>C p.Val797Leu terem sido associadas a alterações no processo de ancoramento do receptor a membrana, os resultados9 demonstraram que estas variantes também apresentam efeito patogênico devido aos baixos níveis de expressão, de ligação à LDL e de internalização do complexo LDLR-LDL, que foram refletidos nos fenótipos dos pacientes.Background: Familial Hypercholesterolemia (FH) is one of the main causes of cardiovascular diseases, caused by genetic variants in LDLR, ApoB and PSCK9 genes. Even the Next Generation Sequencing (NGS) technology being able to identify many genetic variants, only a few were functionally characterized. The use of CRISPR/Cas9 tool allows the construction of experimental models to better characterization of these variants. Objectives: The objective of this work is to functional characterize LDLR variants recently identified in FH patients that lacks functional studies. Methods: Three LDLR variants were selected (rs5928, rs750518671 and rs879254797) for functional studies based on in-silico prediction tools, the affected protein domain, and the minor allele frequency. Different sgRNAs were constructed for each, inserted in PX458 plasmids, cloned, and purified. The constructs were transfected in HepG2 cells and isolated by FACS. LDLR expression assay was evaluated by flow cytometry using Alexa647 conjugated mouse anti-LDLR antibody, and by Western Blotting. Dil-LDL was used to evaluate LDLR activity by flow cytometry. It was also used Oil Red O to evaluate LDLR activity in bright field. Results: Functional analyses of HepG2-rs879254797 transfected cells showed reduced levels either in LDLR expression and in LDLR activity, which agrees with previous docking molecular analyses, that had shown that changing an Asp by a Gly at position 373 shortened the distance between LDLR and ApoB, therefore increasing the interaction bond. Besides, it was verified histologically that HepG2- rs879254797 and HepG2-rs750518671 showed unexpected cellular processes, like cell-cell communication (HepG2-rs879254797), vacuolization and pseudopods (rs750518671). Regarding HepG2-rs5928, there was observed reduced values either in LDLR expression and LDLR activity. Conclusion: Although variants rs5928 and rs750518671 has been described in literature as being associated with fixation process at the cytoplasmatic membrane, we only find differences regarding their LDLR expression and activity, which both variants showed lower levels for both parameters. The HepG2-rs879254797 showed important histological result when incubated with LDL, that could suggest a pathological process.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPHirata, Mario HiroyukiMori, Augusto Akira2023-09-25info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2024-01-23T14:51:04Zoai:teses.usp.br:tde-12122023-113730Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212024-01-23T14:51:04Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
dc.title.none.fl_str_mv |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial Construction of an in vitro models based on CRISPR/Cas9 gene editing aiming to enhance the understanding of genetic influence on Familial Hypercholesterolemia |
title |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial |
spellingShingle |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial Mori, Augusto Akira CRISPR CRISPR/Cas9 Familial Hypercholesterolemia Functional Analyses Hipercolesterolemia Familial LDLR LDLR |
title_short |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial |
title_full |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial |
title_fullStr |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial |
title_full_unstemmed |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial |
title_sort |
Construção de modelo in vitro baseados em edição gênica por CRISPR/cas9 no LDLR visando melhor compreensão da influência genética na hipercolesterolemia familial |
author |
Mori, Augusto Akira |
author_facet |
Mori, Augusto Akira |
author_role |
author |
dc.contributor.none.fl_str_mv |
Hirata, Mario Hiroyuki |
dc.contributor.author.fl_str_mv |
Mori, Augusto Akira |
dc.subject.por.fl_str_mv |
CRISPR CRISPR/Cas9 Familial Hypercholesterolemia Functional Analyses Hipercolesterolemia Familial LDLR LDLR |
topic |
CRISPR CRISPR/Cas9 Familial Hypercholesterolemia Functional Analyses Hipercolesterolemia Familial LDLR LDLR |
description |
A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma das principais causas de doenças cardiovasculares, sendo causado principalmente por variantes genéticas no gene do Receptor de Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDLR). Apesar das tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) serem capazes de identificar diversas variantes, poucas delas foram funcionalmente caracterizadas. A utilização da ferramenta de edição gênica CRISP/Cas9 promove uma edição gênica precisa e permite a criação de modelos experimentais, de forma a contribuir para a melhor validação funcional dessas variantes. O objetivo deste trabalho foi realizar a avaliação funcional de variantes do LDLR identificadas em portadores de HF, através da utilização de CRISPR/Cas9.: Baseado em análises de predição in sílico, do domínio afetado da proteína e na frequência da variante na população, selecionou-se três variantes do LDLR (rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln; rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu e rs879254797 c.1118G>A p.Gly373Asp), e construiu-se três sgRNAs para cada um deles. Os sgRNAs foram inseridos no plasmídeo PX458 previamente digerido com a enzima de restrição BbsI, clonados e purificados em bactérias E. coli DH5α, e co-transfectados com os seus respectivos moldes de reparo de DNA em células HepG2. As células co-transfectadas foram isoladas por FACS, e colocadas em cultura para crescimento e posterior avaliação funcional. A expressão de LDLR foi avaliada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR conjugado com Alexa Fluor-647, e por Western Blotting. A análise de atividade do LDLR foi realizada por citometria de fluxo utilizando-se anticorpo anti-LDLR e Dil-LDL. Realizou-se também análises de microscopia confocal e por microscopia em campo claro utilizando-se marcação com Oil Red O para avaliação da atividade das células cotransfectadas. As variantes foram também analisadas por docking molecular para avaliar o efeito das variantes. Análises funcionais das células HepG2 editadas revelaram menores índices tanto de expressão quanto de ligação a partícula de LDL e internalização do complexo LDLR-LDL, para as três variantes estudadas. A análise de docking molecular para a variante rs879254797 revelou que a troca de um Asp por um Gly na posição 373 diminui a distância de interação entre o LDLR e a ApoB, aumentando a força de interação do complexo e diminuindo o processo de reciclagem do receptor de volta para a membrana. Além disso, verificou-se por microscopia, a ocorrência de processos celulares como comunicação célula-célula e formação de pseudópodes para captura de LDL nas células co-transfectadas com essa variante. Para a variantes rs750518671 c.2389 G>C p.Val797Leu, além da menor expressão, ligação e internalização do complexo LDLR-LDL, observouse também a formação de vacuolização e deposição de lipídeos. Conclui-se com este estudo que, apesar das variantes rs5928 c.2441G>A p.Arg814Gln e rs750518671 c.2389G>C p.Val797Leu terem sido associadas a alterações no processo de ancoramento do receptor a membrana, os resultados9 demonstraram que estas variantes também apresentam efeito patogênico devido aos baixos níveis de expressão, de ligação à LDL e de internalização do complexo LDLR-LDL, que foram refletidos nos fenótipos dos pacientes. |
publishDate |
2023 |
dc.date.none.fl_str_mv |
2023-09-25 |
dc.type.status.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
dc.type.driver.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
format |
doctoralThesis |
status_str |
publishedVersion |
dc.identifier.uri.fl_str_mv |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/ |
url |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-12122023-113730/ |
dc.language.iso.fl_str_mv |
por |
language |
por |
dc.relation.none.fl_str_mv |
|
dc.rights.driver.fl_str_mv |
Liberar o conteúdo para acesso público. info:eu-repo/semantics/openAccess |
rights_invalid_str_mv |
Liberar o conteúdo para acesso público. |
eu_rights_str_mv |
openAccess |
dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf |
dc.coverage.none.fl_str_mv |
|
dc.publisher.none.fl_str_mv |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
publisher.none.fl_str_mv |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP instname:Universidade de São Paulo (USP) instacron:USP |
instname_str |
Universidade de São Paulo (USP) |
instacron_str |
USP |
institution |
USP |
reponame_str |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
collection |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
repository.name.fl_str_mv |
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP) |
repository.mail.fl_str_mv |
virginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.br |
_version_ |
1809090665881010176 |