Bioquímica estrutural da tireotrofina de Arapaima gigas e sua expressão em células de mamífero

• Autor(a) principal: Freire, Renan Passos
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-08112022-105344/
• topic: AlphaFold; Alphafold; HEK293; HEK293; Hormônio Estimulante da Tireoide (TSH); Pirarucu; Pirarucu; Thyroid Stimulating Hormone (TSH)

Introdução: O Pirarucu (Arapaima gigas) é uma espécie de peixe nativa da bacia amazônica que pode alcançar até 200 kg e dois metros de comprimento. Alvo de pesca predatória e modificações ambientais, especialmente político-econômicas, já se nota um relativo declínio da população local e, segundo órgãos fiscalizadores, a espécie está em possível risco de extinção. Há ainda uma dificuldade no manejo em cativeiro, visto sua gama de necessidades nutricionais e comportamentos que ainda são investigados. A tireotrofina (TSH) atua no controle da reprodução em diferentes espécies de peixes. E do ponto de vista ecológico tem sua expressão modificada quando em contato com substâncias poluentes, como metais pesados e agrotóxicos. O TSH é uma glicoproteína de peso molecular variando de 24-28 kDa formada pela ligação não-covalente de duas subunidades alfa e beta, sendo a alfa comum para outros hormônios glicoproteicos, como o FSH, LH e CG. Sua função é bem estabelecida, participando diretamente na síntese dos hormônios tireoidianos (HTs) que atuam no desenvolvimento embrionário, modulação da atividade cerebral, gonadal, hepática, entre outros. Objetivos: Obter a subunidade beta do TSH de Arapaima gigas, caracterizar sua estrutura in silico e expressar em células de mamífero. Metodologia: Foram utilizadas metodologias de identificação genômica da subunidade beta in silico e construção da estrutura do heterodímero com técnicas de inteligência artificial. Aplicou-se duas ferramentas de predição: gênica (Gnomon) e estrutural (Alphafold), como também se realizou in silico estudos sobre distância evolutiva, dinâmica molecular e propriedades físico-químicas. As informações recuperadas das predições foram em parte confirmadas com PCR de hipófises retiradas de Pirarucus e a expressão de agTSH em células de mamífero HEK293F. Resultados: A similaridade da cadeia beta variou de 40,10-81,60% entre 39 espécies alinhadas com a sequência obtida. São 146 aminoácidos com 12 cisteínas (que formam seis pontes dissulfeto) e um único sítio de N-glicosilação conservados. A árvore filogenética construída indica maior grau de parentesco com a ordem elopiformes e clupeiformes. A estrutura do heterodímero é majoritariamente polar, com predominância de folhas-beta na sua estrutura secundária, sendo uma citocina com nó de cistina (CATH 2.10.90.10). Os estudos de dinâmica molecular da interação do TSH com receptor do seu ancestral comum, Aruanã-dourado (S. formosus), ambos resolvidos por Alphafold, apontam valores comparáveis ao modelo humano, com diferença de valores relacionados a energia de ligação (ΔG) entre 1,50-8,64%, indicando um caminho para estudos in vitro e in vivo. Sua expressão, feita de maneira transiente, obteve rendimento de agTSH 25 mg/L, similar a trabalho anterior com agFSH 28 mg/L, quantificados através de técnicas cromatográficas no meio condicionado. Conclusões: A região codificante e 3\' não traduzida da subunidade beta foi identificada e utilizada juntamente com a subunidade alfa para a produção de agTSH em células HEK293. A metodologia utilizada poderá ser aplicada para que novas proteínas da espécie sejam descritas. Muito embora ainda requeria otimização para aumento da expressão, este trabalho contribuirá para que futuros estudos explorem sua atividade biológica, investigando a eficiência quanto à reprodução e melhoria da capacidade reprodutiva em cativeiro do pirarucu.