Obtenção e caracterização estrutural da proteí­na humana Quinase Dependente de Ciclina 9 (CDK9) utilizando o sistema bacteriano de Escherichia coli

• Autor(a) principal: Alencar, Diandra Pinheiro
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-15102019-155920/
• topic: caracterização estrutural; CDKs; CDKs; cyclin-dependent kinase 9; expressão heteróloga; heterologous expression; quinase dependente de ciclina 9; structural characterization

Quinases dependentes de ciclinas (CDKs) são enzimas que possuem funções específicas ou redundantes no ciclo celular e na transcrição genética, e possuem atividade de serina/treonina quinase, a qual é regulada por uma outra proteína denominada ciclina. No genoma humano já foram identificadas 21 CDKs, sendo as CDKs 1-6, 11P58, 11P110 e 14-18 reguladoras do ciclo celular, e as CDKs 7-10, 12, 13, 19, 20 reguladoras da transcrição. Este trabalho de pesquisa buscou expressar a CDK9 no sistema bacteriano de Escherichia coli, purifica-la por cromatografia líquida de alta eficiência, estudar sua estrutura nativa e verificar sua interação com o ATP. Diversos testes de expressão da CDK9 na cepa de E. coli BL21(DE3) foram realizados, nos quais as variáveis foram temperatura e tempo de indução. Nos experimentos, a CDK9 foi obtida insolúvel; portanto, após a lise celular, foram testados métodos de solubilização e de cromatografia (de interação hidrofóbica, de afinidade a íon metálico e de exclusão molecular), em várias condições experimentais, para o reenovelamento e purificação da proteína de interesse. Após a otimização das etapas de expressão e purificação, foram realizados experimentos de caracterização e estabilidade estruturais. O espectro de dicroísmo circular (CD) da CDK9, purificada e reenovelada em coluna de afinidade, apresentou elementos de estrutura secundária muito próximos aos encontrados na literatura. A desnaturação térmica monitorada por CD se mostrou um processo de dois estados (nativo e desenovelado); com a temperatura de desnaturação da CDK9 determinada em aproximadamente 65,9°C, na concentração de 6 µM. A desnaturação química induzida por ureia, medida por fluorescência, foi também caracterizada como um processo de dois estados. O experimento de titulação da proteína com ATP mostrou a supressão da fluorescência intrínseca da CDK9 como resultado da interação proteína-ligante. Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que a expressão heteróloga da CDK9 em E. coli, e os métodos de reenovelamento e purificação, os quais apresentam procedimentos simples e não requerem materiais de alto custo, foram eficazes na obtenção da CDK9 nativa em alto rendimento, podendo assim, ser aplicados para novos estudos in vitro da CDK9.