Utilização de shRNA anti-hexon, anti-IVa2 e anti-pol durante a produção de vírus adeno-associado como estratégia de eliminar Adenovírus helper: prova de princípio

• Autor(a) principal: Lana, Marlous Vinicius Gomes
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5155/tde-13032017-101533/
• topic: Adenoviridae; Adenoviridae; Adenoviridae hexon protein; Adenoviridae replication; Gene therapy; Helper viruses; Interferencia de RNA; Proteina hexon de adenovirus; Replicacao viral; shRNAs; Terapia genetica; Virus auxiliares

O Adenovírus (Ad) é um agente etiológico que causa infecções em diversas espécies e também pode ser utilizado na forma de vetor como ferramenta tecnológica para terapia gênica. O Controle sobre a replicação de Ad pode trazer beneficio para o combate de infecções e para as tecnologias de transferência genica. Porém, poucas ferramentas existem que podem inibir a replicação de Ad. Uma aplicação importante seria a inibição da replicação de Adenovírus helper utilizado na produção de Vírus Adenoassociado recombinante (rAAV), assim minimizando contaminação da produção de rAAV com o virus helper. Dessa maneira o objetivo desse trabalho foi investigar se há inibição da replicação do Ad mediada por RNA de interferência (RNAi) direcionada para alvos adenovirais chaves. Para isso foram construídos vetores lentivirais que codificam shRNAs para os genes hexon, IVa2 e pol. Em seguida foram criadas linhagens que expressam constitutivamente os shRNAs em 293T, células onde os vetores adenovirais conseguem se replicar. Os shRNAs específicos para hexon e IVa2 promoverem significantemente a redução dos níveis destes mRNAs conforme revelado utilizando RT-qPCR para quantificação dos transcritos adenovirais. Em seguida, knockdown do gene hexon se mostrou promissor em inibir a replicação do Ad, visto como redução de vírus produzido em células 293T anti-hexon. O knockdown do transcrito de hexon e a redução em replicação de Adenovírus foram mais acentuados após cell sorting e obtenção de clones celulares a partir da linhagem anti-hexon. O clone anti-hexon mostrou significante redução na quantidade de partículas adenovirais visualizadas por microscopia eletrônica e redução de 92% das partículas infecciosas em relação a 293T quando a produção foi realizada em larga escala. Esses resultados indicam que a tecnologia de shRNA para inibir a replicação do Ad é promissora e representa o primeiro passo de desenvolvimento de uma estratégia para a produção de rAAV livre de contaminação com Ad helper