Clonagem, expressão, purificação e caracterização da proteína ciclina D3 obtida pela expressão em sistema bacteriano (Escherichia coli)

• Autor(a) principal: Coelho, Fernanda
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-17112022-110011/
• topic: atividade quinase; expressão heteróloga; heterologous expression; kinase activity; proteínas recombinantes; protocolo de reenovelamento; recombinant proteins; refolding protocol

Proteínas quinases são importantes alvos de estudo devido atuarem como reguladores diretos do ciclo celular. A progressão do ciclo de divisão celular é conduzida por ciclinas, que ligam e ativam seus parceiros catalíticos, as quinases dependentes de ciclina (CDKs). As CDKs compreendem uma família de proteínas que podem ser subdivididas em dois grupos funcionais majoritários baseados na sua função no ciclo celular e/ou controle transcricional. Os complexos heterodiméricos específicos de CDK-ciclina fosforilam diversas proteínas celulares, as quais promovem a entrada no ciclo celular, a regulação da síntese de DNA e a segregação dos cromossomos recém-duplicados durante a mitose. A ciclina D3 tem como função atuar na fase G1 como subunidade reguladora de CDK4 e CDK6, e também como parceiro da CDK11p58 na fase G2/M durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão da ciclina D3 se correlaciona com o aumento da proliferação celular e crescimento tumoral, além de ser capaz de inibir a atividade de transativação do receptor de andrógenos. O objetivo do presente estudo é a superexpressão da ciclina D3 utilizando o sistema de expressão bacteriano (Escherichia coli) a fim de obter a proteina purificada e com pureza adequada para a realização de ensaios de caracterização estrutural e de atividade quinase do complexo CDK11Δ-ciclinaD3. A utilização de diferentes tipos de vetores permitiu obter a proteina de interesse por meio de processo de reenovelamento e de forma nativa. Os resultados obtidos para a expressão em ambos os vetores, produziram proteinas com mais de 95% de pureza. Os ensaios de caracterização por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) da proteína ciclina D3 na forma nativa (solúvel) apresentou um padrão muito parecido de estruturas secundárias por CD quando comparado ao resultado da proteína reenovelada, com cerca de 39% de hélices α e 15% de fitas β. Por espectroscopia de emissão de fluorescência, foi demonstrado que a proteína é estável frente ao agente caotrópico ureia, porém instável na presença de concentrações crescentes de cloreto de guanidina. O ensaio de atividade quinase do complexo CDK11Δ-ciclinaD3 permitiu assegurar a conformaçao correta das proteinas recombinates obtidas em ambos os vetores. Esses dados validam o protocolo de reenovelamento, servindo de base para estudos futuros envolvendo a produção de proteínas recombinantes e para estudos envolvendo possíveis inibidores para este complexo.