Isolamento de genes que codificam proteínas excretadas-secretadas pelo Trypanosoma cruzi (TESA) com potencial para imunodiagnóstico

• Autor(a) principal: Matsumoto, Tokiko Kyomen
• Data de Publicação: 2002
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9136/tde-07032023-153607/
• topic: Doença de chagas (Imunologia); Doença de chagas (Imunologia); Imunogenética; Imunogenética; Trypanosoma cruzi (Imunologia); Trypanosoma cruzi (Imunologia)

O perfil de antigenicidade das proteínas excretadas-secretadas pelas formas tripomastigotas (TESA) do T. cruzi apresenta, por immunoblotting (TESA-blot), duas moléculas imunodominantes que permitem o diagnóstico diferencial da doença de Chagas. TESA-blot mostra uma banda de 150-160 kDa amplamente reconhecida por soros de pacientes de fase crônica e uma outra, denominada SAPA (shed acute phase antigen), preferencialmente reativa com soros da fase aguda da doença de Chagas (Umezawa et al., 1996b). Além disso, moléculas de 160 kDa presentes somente na infecção ativa, consideradas potentes candidatas como marcadores de cura da doença de Chagas, foram descritas como alvo de anticorpos líticos (Krautz et al., 2000). A relevância destes antígenos orientou-nos na seleção de genes que codificam TESA das bibliotecas de DNA e de cDNA do T. cruzi, através de anticorpos anti-TESA ou sonda, para finalidades diagnósticas. Na primeira etapa, o clone recombinante TESA-1 foi selecionado de uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída em λgt11 , com anticorpos anti-TESA purificados de um \"pool\" de soros chagásicos crônicos. O fragmento de 203 pbs do inserto de TESA-1 foi identificado com os genes CRP e FL-160 do Grupo III da Família Trans-sialidase que codificam proteínas de 160 kDa presentes na fração TESA do T. cruzi. TESA-1 expressou, em pGEX, um peptídeo solúvel de 10 kDa, especificamente reativo com soros de pacientes chagásicos. Soro hiperimune anti-TESA-1 demonstrou a presença do epítopo de TESA-1 nos antígenos tripomastigota e amastigota do T. cruzi, assim como reconheceu a banda de 150-160 kDa da fração TESA de 8 cepas do T. cruzi. Apesar de representar aproximadamente 8% dos genes CRP e FL-160 que codificam proteínas de 160 kDa, o epítopo de TESA-1 mostrou capacidade de reagir com 82,2% dos soros de pacientes chagásicos por Immunoblotting, com uma especificidade de 93,3%. Na segunda etapa, o próprio inserto do clone TESA-1 utilizado como sonda selecionou os clones 8a, 12a, 15b e 16a da biblioteca de cDNA do T. cruzi, construída em λZAP. A alta homologia destes clones com o gene Tc 13 do Grupo IV da Família Trans-sialidase do T. cruzi indica que a 103 sequência de TESA-1 poderá ser usada como alvo para a identificação deste grupo de moléculas ainda pouco estudadas. Na terceira etapa, anticorpos anti-TESA purificados de soros de pacientes das fases aguda e crônica da doença de Chagas selecionaram 26 clones da biblioteca de cDNA do T. cruzi, em λZAP. Desta seleção, 8 clones não mostraram identidade com qualquer sequência conhecida do T. cruzi e 15, foram identificados com genes da família Trans-sialidase (14 com os genes CEA, CRP e FL-160 de 160 kDa do Grupo III e 1 com o gene da TCNA/TCTS/SAPA do Grupo 1). Além disso, foram identificados outros clones não relacionados com a Família Trans-sialidase: 2 com a Família Hsp 70 e 1 com a desidrogenase do T. cruzi. As proteínas expressas pelos 31 clones recombinantes selecionados foram analisadas por Dot-blot com anticorpos anti-TESA purificados por afinidade de 8 soros de pacientes chagásicos (1 de fase aguda e 7 de fase crônica). Pelo Dot-blot, anticorpos anti-TESA purificados de soros chagásicos crônicos reconheceram somente proteínas expressas pelos clones recombinantes homólogos ao Grupo III. Somente o antígeno expresso pelo clone similar a TCNA/TCTS/SAPA reagiu com anticorpos anti-TESA purificados de soro chagásico agudo. Os clones recombinantes selecionados resultaram no fornecimento de uma importante fonte de proteínas excretadas e secretadas, especificamente reativas com anticorpos de pacientes chagásicos, que poderão ser úteis para o imunodiagnóstico da doença de Chagas. A grande quantidade de clones homólogos às proteínas de 160 kDa do T. cruzi possibilita o emprego, tanto individual como em mistura, dessas proteínas recombinantes para discriminar as fases da doença de Chagas ou monitorar a cura de pacientes submetidos ao tratamento específico para esta doença. Além disso, a mistura de antígenos recombinantes homólogos às proteínas de 160 kDa do T. cruzi com aqueles homólogos à TCNA/TCTS/SAPA poderá fornecer um teste altamente sensível e eficaz para o sorodiagnóstico da doença de Chagas.