Estudos da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase por EPR convencional e da estrutura dinâmica de biomembranas por EPR pulsada bidimensional

• Autor(a) principal: Costa Filho, Antônio José da
• Data de Publicação: 2001
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76131/tde-06062007-181913/
• topic: Centrose de ferro; Dioxigenases; Dioxygenases; EPR; Iron centers; Model membranes; Modelos de membranas; Pulsed EPR; Ressonância RPE; RPE pulsado

Neste trabalho, usamos a técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica em seu modo convencional para o estudo da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase e em seu modo pulsado para o estudo da estrutura dinâmica de biomembranas. Clorocatecol 1,2-dioxigenase é uma enzima que catalisa a clivagem de estruturas aromáticas, como a do clorocatecol, via a a ativação e incorporação de uma molécula de oxigênio e que possui em seu sítio ativo um íon Fe(III). Nossos resultados de CD e atividade enzimática mostram o intervalo de temperaturas entre 20-25 ºC como aquele no qual a enzima apresenta atividade máxima. A maior contribuição para sua estrutura secundária vem de folhas β anti-paralela. A quantificação do número de spin feita por EPR indicou a presença de um íon Fe(III) por molécula de CCD, estando esse íon em estado de spin alto e simetria rômbica, como se depreende da linha estreita em g=4,3. Os parâmetros de desdobramentos de campo zero foram determinados pela medida em função da temperatura da linha em g=4,3, fornecendo λ=E/D=1/3 e D=(1,3±0,2) cm -1. O gráfico de Scatchard construído a partir dos espectros de EPR quando da titulação da enzima com o substrato catecol indicou a presença de um único sítio ligante de catecol, em acordo com a quantificação anterior do metal, e cuja constante de afinidade enzima-substrato é k=(2,7±0,1)x10-6 M. No que tange a EPR pulsado, foram utilizadas as chamadas técnicas modernas de EPR, com ênfase em 2D-ELDOR, para a investigação de diversos aspectos em membranas de interesse biológico. Primeiramente, investigamos a diferenciação entre a fase de líquido ordenado (Lo) e a de líquido cristalino (Lc) em membranas modelo de lipídio puro e lipídio/colesterol (1/1) contendo diferentes marcadores de spin (16-PC, CSL e DPPTC). Aí mostramos que é possível distinguir-se diferentes fases lipídicas apenas por simples inspeção visual dos espectros de 2D-ELDOR de um determinado marcador de spin incorporado à membrana. Além disso, realizamos simulações através do pacote de programas NLSPMC e determinamos as diferenças quantitativas entre as fases lipídicas: o estado de líquido ordenado apresenta maior fluidez e ordenamento na região das cadeias acílicas, ao passo que, na região da cabeça polar, mostra menor ordenamento. Em seguida, estudamos o efeito da presença de colesterol em alta concentração sobre o comportamento da membrana como função da temperatura. Nesse caso, o colesterol atua de maneira a manter a membrana em uma fase altamente ordenada e fluída dentro do intervalo de temperaturas medido, abolindo a transição gel-Lc do lipídio DPPC. Uma tentativa de aplicação de nossa metodologia ao estudo de membranas biológicas foi feita ao estudarmos membranas bleb que são ricas em colesterol. Estas mostram comportamento semelhante àquele observado para as membranas modelo com alta concentração de colesterol, um indicativo da existência de domínios Lo naquelas membranas biológicas. Por fim, estudamos o efeito da presença do peptídeo Gramicidina A\' (GA) sobre a estrutura da membrana de DPPC. Os resultados de 2DELDOR mostram claramente a presença de duas populações de lipídios (\"boundary\" e \"bulk\"). As simulações desses espectros foram as primeiras feitas com espectros contendo duas componentes e com os dados nas formas Sc- e Secsy. Essas mostram que os lipídios \"bulk\" são pouco afetados pela presença de moléculas de GA, ao passo que os lipídios \"boundary\" têm suas cadeias acílicas dobradas na porção terminal em torno das moléculas de GA, mecanismo que suporta a formação de domínios em fase HII na membrana.