Desenvolvimento de um biomarcador molecular baseado no comprimento de telômeros em peixes da espécie Rhamdia quelen (ordem siluriforme)

• Autor(a) principal: Zimmer, Douglas Fernando
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UTFPR (da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (RIUT))
• Texto Completo: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/29466
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS; Telômero; Peixes; DNA; Telomere; Fishes

Nas últimas décadas, o Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) visa estabelecer a diretriz dos 3Rs: do inglês Replace (Substituição), Reduce (Redução) e Refine (Refinamento). Neste contexto, há a necessidade de adaptar ensaios ecotoxicológicos para novos bioindicadores, sendo priorizado a adoção de peixes nas novas pesquisas. Um campo que vem ganhando destaque nos últimos anos é a mensuração de telômeros, sendo que estes são estruturas presentes nas extremidades dos cromossomos sendo constituídos de DNA não codificante atuam na proteção do DNA e na regulação da senescência celular, retardando o encurtamento cromossômico e a eventual perda de regiões de genes codificantes a cada divisão celular. Nesse panorama, esta pesquisa tem por objetivo a elaboração de um protocolo padronizado de mensuração de telômeros, capaz de analisar o estresse oxidativo causado por poluentes em peixes de clima neotropical da espécie Rhamdia quelen, popularmente conhecido como Jundiá. Para esta pesquisa foram adquiridos cinco indivíduos provenientes do grupo controle de um bioensaio de exposição a efluente têxtil na piscicultura da UTFPR - Campus Dois Vizinhos. Foi coletado amostras de músculo dos indivíduos, sendo estes armazenados em temperatura de -80°C até posterior etapa de extração e amplificação do DNA. A amplificação do DNA foi realizada por duas técnicas, a primeira, denominada PCR endpoint caracterizada por ser uma técnica qualitativa e que foi utilizada para fornecer parâmetros iniciais para amplificar a região telomérica, uma vez que está técnica é mais acessível que a segunda técnica utilizada nesta pesquisa, denominada qPCR, também denominada PCR quantitativa. Através da qPCR é possível efetivamente mensurar o tamanho relativo dos telômeros com base na mensuração de um gene endógeno, aqui utilizado o gene GAPDH. A padronização foi obtida com sucesso tanto para telômeros quanto para o gene GAPDH, com cycle threshold (Ct) médio de 15,251 e 29,773, respectivamente. Através dos Cts médios foi possível calcular o valor de ACt, o qual fornece a diferença na quantidade de moléculas, em ciclos, da região alvo e do gene endógeno. A diferença entre a região telomérica de Rhamdia quelen e o gene endógeno GAPDH é de 14,522, ou seja, são necessários 14,5 ciclos a mais para iniciar o sinal de amplificação do gene GAPDH. Através da obtenção deste valor, pode-se concluir que, em ensaios ecotoxicológicos futuros, valores abaixo de 14,522 podem significar alteração em telômeros, resultado de estresse oxidativo causados por um ou mais poluentes presentes no meio em que o bioindicador está exposto.