Purificação, caracterização e imobilização de lacases de basidiomicetos e seu uso na degradação simultânea de rifampicina e isoniazida

• Autor(a) principal: Riedi, Halanna de Paula
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UTFPR (da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (RIUT))
• Texto Completo: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/4205
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::ENZIMOLOGIA; Antibióticos; Pleurotus ostreatus; Tuberculose - Tratamento; Enzimas; Fungos; Enzimas imobilizadas; Antibiotics; Pleurotus ostreatus; Tuberculosis - Treatment; Enzymes; Fungi; Immobilized enzyme; Ciências Ambientais

A rifampicina e a isoniazida são antibióticos utilizados para o tratamento da tuberculose. Cerca de 30% dos fármacos são expelidos do corpo em sua forma inalterada e quando não tratados adequadamente em estações de tratamento de água e esgoto, podem ser responsáveis pela proliferação de cepas bacterianas resistentes. Diferentes técnicas têm sido propostas para o tratamento de fármacos no ambiente, incluindo métodos biológicos com o uso de enzimas fúngicas. Dentre elas a aplicação de lacases imobilizadas pela técnica de cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) para a biodegradação de micropoluentes é uma alternativa promissora. Nesse trabalho foram avaliadas a purificação, caracterização e a imobilização de lacases de basidiomicetos pelo método de CLEAs para posterior aplicação das enzimas como agentes biodegradadores da rifampicina e isoniazida. O trabalho foi dividido em seis etapas, sendo essas: (1) produção de lacases por basidiomicetos, resultando em atividades máximas para Trametes sp. de 9413,91 U/L e para Pleurotus ostreatus de 12296,03 U/L; (2) imobilização das enzimas em CLEAs no qual obteve-se taxa de 16,42% de imobilização; (3) purificação das lacases obtidas por precipitação com (NH4)2SO4, diálise e cromatografia em gel gerando atividade específica de 7,77 U/mg para Trametes sp. e 6,3 U/mg para P. ostreatus; (4) caracterização das enzimas com relação aos efeitos do pH, temperatura e determinação das constantes cinéticas, na qual foi possível observar que para as duas lacases o pH ótimo foi 4,0, com estabilidade na faixa de 3,0 a 5,0 e temperatura ótima de 60°C e termoestabilidade entre 20 a 50°C por 1 hora. Já para as enzimas imobilizadas notou-se aumento na estabilidade em relação a todos os pHs e na temperatura de 20 a 60°C. Para as lacases livres de Trametes sp. o Km foi de 1 mM e Vmax de 454 µmol/min e para os CLEAs foi 3,94 e 140,84 respectivamente. Para a enzima livre de P. ostreatus o Km foi de 2,1 mM e Vmax de 1000 µmol/min enquanto que a imobilizada apresentou Km de 2,57 mM e Vmax de 70,42 µmol/min; (5) a biodegradação simultânea dos fármacos resultou em melhor desempenho no tratamento da isoniazida utilizando as enzimas imobilizadas com 71% de remoção para Trametes sp., enquanto a aplicação da lacase livre resultou em 32%. Para o fungo P. ostreatus os resultados foram similares, com 68,8% de remoção utilizando CLEAs e 26,4% com enzimas livres. Para a rifampicina não houve diferença significativa entre os dois tratamentos, sendo que ambos apresentaram mais de 93% de remoção total; (6) as análises antimicrobianas das soluções após os tratamentos enzimáticos demonstraram que a rifampicina ainda conservava suas propriedades, inibindo crescimento em baixas concentrações de 0,22 mg/L.