Expressão, purificação e caracterização de uma catalase de Serratia marcescens

• Autor(a) principal: Pacheco, Alberto Enrique Maestre
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UTFPR (da Universidade Tecnológica Federal do Paraná (RIUT))
• Texto Completo: http://repositorio.utfpr.edu.br/jspui/handle/1/25527
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS; Enzimas - Aplicações industriais; Biotecnologia; Peróxido de hidrogênio; Catalase; Serratia marcescens; Enzymes - Industrial applications; Biotechnology; Hydrogen peroxide; Biotecnologia

As enzimas constituem um fator fundamental em diversos processos indústrias devido a sua alta eficiência catalítica e o baixo consumo de energia. Dessa forma, os microrganismos graças ao seu rápido crescimento, versatilidade, altos níveis de produção, se tornam uma fonte importante de enzimas de interesse industrial; como as catalases, que são caracterizadas pelas suas aplicações em diferentes setores: alimentício, têxteis, farmacológico, odontológico, entre outros; contudo, existem algumas limitações para a produção de muitas enzimas microbianas por processos convencionais, uma dessas limitações é a dificuldade de mimetizar as condições ambientais e nutricionais para o crescimento de alguns microrganismos no nível laboratorial, assim, algumas técnicas da engenharia genética como a expressão heteróloga em diferentes sistemas de expressão, como a E. coli e a Pichia pastoris, constituem uma alternativa interessante dado que representam sistemas de expressão versáteis para a produção de inumeráveis enzimas e produtos de interesse biotecnológico a larga escala. Este trabalho tem como objetivo principal o estabelecimento de um sistema de expressão recombinante de uma catalase de Serratia marcescens em células de Pichia pastoris e E. coli. O fragmento Kat (codifica para uma catalase alcalina) da linhagem bacteriana Serratia marcescens FZSF01 foi subclonado previamente nos vetores de expressão pPICZαA e pET-28a. O plasmídeo recombinante pPICZαA_Kat foi utilizado para transformar células de P. pastoris KM71H e X-33, enquanto o vetor recombinante pET-28_Kat foi utilizado para transformar células de E. coli Rosetta(DE3). Os clones recombinantes de P.pastoris KM71H e X-33 foram induzidos com metanol (na concentração final de 0,75% e 1% respectivamente) por um período de 144 horas. A indução da expressão em E.coli foi feita com IPTG numa concentração final de 0,4 mM a 37ºC e a purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina de níquel. A atividade enzimática da catalase purificada foi realizada pelo método espectrofotométrico. As análises de expressão e purificação foram feitas em SDSPAGE 12% corado com Comassie. A expressão da catalase em P. pastoris foi observada em pequena escala, sendo necessária a padronização dos ensaios de expressão a maior escala. Em células de E.coli Rosetta (DE3) apresentou significativas taxas de expressão, mostrando-se parcialmente solúvel o que permitiu realizar a purificação da proteína, obtendo-se um rendimento de 0,51 mg por litro de cultura. Posteriormente foram feitos os ensaios enzimáticos que demonstraram que a catalase estava ativa e que apresentou um comportamento Michaeliano.