Avaliação das propriedades bioquímicas e físico-químicas da enzima asparaginase produzida por Phichia pastoris recombinante

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pinheiro, Adriana Michelli Silva
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/13448
Resumo: A asparaginase de origem bacteriana é o principal medicamento para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda, um câncer que afeta principalmente as crianças. Apesar de efetivo, o medicamento causa sérias reações imunológicas por ser produzido por um procarioto. Atualmente, o medicamento existente no mercado brasileiro é importado, o que acarreta dependência tecnológica, alto custo na obtenção do medicamento e dificuldade de abastecimento. As asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene ASP3 apresenta, por suas características, potencial para uso como medicamento antileucêmico. Em trabalhos anteriores, este gene foi clonado e expresso em altos níveis na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas e bioquímicas da asparaginase periplásmica recombinante produzida por P. pastoris, tendo sido avaliados as melhores condições de estocagem da enzima após ressuspensão, o efeito de alguns íons e de alguns compostos na atividade asparaginásica, a afinidade da asparaginase pelos substratos D e L-asparagina e L-glutamina e os seus parâmetros cinéticos. Observou-se que a ressuspensão da asparaginase de levedura em água destilada e mantida a 4 °C reteve em torno de 98% da atividade original após 96 horas, na presença de sorbitol 0,1 M, mostrando ser esta a melhor condição de estocagem. Os valores do Km e da Vmáx foram determinados, obtendo-se 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectivamente. A asparaginase de P.pastoris recombinante apresentou maior afinidade pela D-asparagina, de forma semelhante à asparaginase nativa de S. cerevisiae; e baixa atividade glutaminásica, o que favorece a sua utilização como medicamento pelo menor risco de efeitos tóxicos. O EDTA não apresentou efeito negativo sobre a asparaginase de levedura, indicando não ser a mesma uma metaloenzima. A influência negativa de agentes redutores sobre a atividade enzimática indica a presença de pontes de enxofre na estrutura proteica. Os resultados obtidos são de extrema importância para a continuidade dos estudos da utilização da asparaginase de Pichia pastoris recombinante como agente antileucêmico.
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spelling Pinheiro, Adriana Michelli SilvaTeixeira, Ricardo SposinaFerrara, Maria AntonietaOliveira, Maria MoraesSouza, Mariana Conceição deFerrara, Maria Antonieta2016-04-04T12:26:00Z2016-04-04T12:26:00Z2015PINHEIRO, Adriana Michelli Silva. Avaliação das propriedades bioquímicas e físico-químicas da enzima asparaginase produzida por Phichia pastoris recombinante. 2015. 58 f. Dissertação (Mestrado em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica) - Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos, Rio de Janeiro, 2015.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/13448A asparaginase de origem bacteriana é o principal medicamento para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda, um câncer que afeta principalmente as crianças. Apesar de efetivo, o medicamento causa sérias reações imunológicas por ser produzido por um procarioto. Atualmente, o medicamento existente no mercado brasileiro é importado, o que acarreta dependência tecnológica, alto custo na obtenção do medicamento e dificuldade de abastecimento. As asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae codificada pelo gene ASP3 apresenta, por suas características, potencial para uso como medicamento antileucêmico. Em trabalhos anteriores, este gene foi clonado e expresso em altos níveis na levedura Pichia pastoris. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar as propriedades físico-químicas e bioquímicas da asparaginase periplásmica recombinante produzida por P. pastoris, tendo sido avaliados as melhores condições de estocagem da enzima após ressuspensão, o efeito de alguns íons e de alguns compostos na atividade asparaginásica, a afinidade da asparaginase pelos substratos D e L-asparagina e L-glutamina e os seus parâmetros cinéticos. Observou-se que a ressuspensão da asparaginase de levedura em água destilada e mantida a 4 °C reteve em torno de 98% da atividade original após 96 horas, na presença de sorbitol 0,1 M, mostrando ser esta a melhor condição de estocagem. Os valores do Km e da Vmáx foram determinados, obtendo-se 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectivamente. A asparaginase de P.pastoris recombinante apresentou maior afinidade pela D-asparagina, de forma semelhante à asparaginase nativa de S. cerevisiae; e baixa atividade glutaminásica, o que favorece a sua utilização como medicamento pelo menor risco de efeitos tóxicos. O EDTA não apresentou efeito negativo sobre a asparaginase de levedura, indicando não ser a mesma uma metaloenzima. A influência negativa de agentes redutores sobre a atividade enzimática indica a presença de pontes de enxofre na estrutura proteica. Os resultados obtidos são de extrema importância para a continuidade dos estudos da utilização da asparaginase de Pichia pastoris recombinante como agente antileucêmico.Bacterial asparaginase is the main medicament for the treatment of acute lymphoblastic leukemia, a cancer that primarily affects children. Although effective, the medicine causes serious immunological reactions due to its prokaryotic origin. Currently, the existing drug in the Brazilian market is imported, which carries a technological dependence, high cost and supply difficulties. The asparaginase II of Saccharomyces cerevisiae encoded by the ASP3 gene, given its characteristics, has potential to be used as an antileukemic drug. In previous work, this gene was cloned and expressed at high levels in the yeast Pichia pastoris. The present work aimed to characterize the physicochemical and biochemical properties of the recombinant periplasmic asparaginase produced by P. pastoris, having been assessed the best enzyme storage conditions after resuspension, the effect of some ions and some compounds in asparaginasic activity, asparaginase affinity for yhe substrates D- and L-asparagine and Lglutamine and its kinetic parameters. It was observed that the yeast asparaginase resuspension in distilled water and kept at 4 °C retained about 98% of the original activity after 96 hours in the presence of 0.1 M sorbitol, showing this to be the best storage condition. The values of Km and Vmax were determined to be 2,461 ± 0,170mM e 0,090 ± 0,0017mM min-1, respectively. The recombinant asparaginase showed higher affinity for D-asparagine, similarly to the native S. cerevisiae asparaginase; and low glutaminasic activity, which favors its use as a medicine due to the lower risk of toxic effects. EDTA showed no negative effect on the yeast asparaginase, indicating that it is not a metalloenzyme. The negative influence of reducing agents on the enzymatic activity indicates the presence of sulfur bridges in the protein structure. These results are extremely important for the further studies on the use of the recombinant Pichia pastoris asparaginase as antileukemic agent.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/Farmanguinhos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porCinética enzimáticaAsparaginasePichia PastorisCâncerLeucemia Linfoblástica AgudaAsparaginaseCancerPichia PastorisAcute Lymphoblastic LeukemiaEnzyme KineticsAsparaginaseNeoplasiasLeucemiaAvaliação das propriedades bioquímicas e físico-químicas da enzima asparaginase produzida por Phichia pastoris recombinanteEvaluation of biochemical and physicochemical properties of the enzyme asparaginase produced by recombinant Phichia pastorisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2015-05-29Instituto de Tecnologia em FármacosFundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Fármacos/FarmanguinhosMestrado ProfissionalRio de Janeiro/RJPós-graduação em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêuticainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZORIGINAL14.pdfapplication/pdf930696https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/13448/1/14.pdf4334fa07716ed0ea4227a0d296d9310cMD51LICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/13448/2/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD52TEXT14.pdf.txt14.pdf.txtExtracted texttext/plain82755https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/13448/3/14.pdf.txt5e21b6a87f0a57d5589700f212529269MD53icict/134482018-07-02 09:02:40.171oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352018-07-02T12:02:40Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false
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