Estudo de proteínas candidatas ao poro associado ao receptor P2X7 em diferentes tipos celulares

• Main Author: Oliveira, Carla Santos de
• Publication Date: 2016
• Format: Doctoral thesis
• Language: por
• Source: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Download full: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/44257
• topic: Receptores Purinérgicos P2X7; Complexo de Proteínas Formadoras de Poros Nucleares; Receptores Purinérgicos P2X7; Complexo de Proteínas Formadoras de Poros Nucleares

O receptor P2X7 (P2X7R) é um receptor purinérgico, que difere de outros subtipos, devido às suas características estruturais e farmacológicas. Quando exposto por um período prolongado ou à altas concentrações de seu agonista natural, promove um aumento na permeabilidade da membrana plasmática, permitindo a passagem de moléculas de até 900 Da, em macrófagos. Há uma controvérsia entre vários autores, que deixa em dúvida se esse receptor necessita de uma segunda proteína, para a formação de poros, além da identidade desta proteína. Selecionamos cinco proteínas formadoras de poros: TRPV1, TRPA1, Conexinas-43 (Cx-43), Panexina-1 (Panx-1) e VDAC. Acreditamos que diferentes proteínas poderiam estar associadas ao P2X7R, dependendo do tipo celular e dos estímulos do microambiente. Nesse contexto, o principal objetivo deste trabalho é identificar qual(is) proteína(s) poderia(m) estar associada(s) ao poro do P2X7R e se, essa associação, seria dependente do tipo de celular em que se encontram. Fizemos a técnica de RT-PCR das linhagens celulares: J774.G8, N2A, U373, U937, células HEK-293 e células primárias de ratos Wistars e camundongos Swiss Webster, para identificarmos a expressão do RNAm das proteínas descritas acima. A etapa seguinte, foi verificar se as proteínas formadoras de poros; TRPV1, TRPA1, Cx-43, Panexina-1 poderiam estar fisicamente associadas com o P2X7R. As células foram tratadas com ou sem ATP 5 Mm e em seguida a imunoprecipitação de P2X7R e das proteínas descritas foi realizada. As amostras foram resolvidas em gel de poliacrilamida e analisadas por espectrometria de massas ou western blot Nesse ponto, a presença de P2X7R foi confirmada e em seguida observamos que diferentes proteínas estavam associadas ao P2X7R sob diferentes condições, principalmente quando expostas à ATP 5 mM. Células U937 e N2A, quando tratadas com ATP 5 mM, apresentaram uma diminuição na expressão de P2X7R associado ao TRPV1. Enquanto que a associação observada com as proteínas Panx-1 e Cx-43 permanecia igual (independente da presença do ATP). Em seguida, realizamos um ensaio de permeabilização por YO-PRO-1 em células J774.G8, HEK-293, hP2X7-HEK-293 e BMDM de camundongos C57BL/6, utilizando agonistas e antagonistas do P2X7R e das proteínas candidatas descritas acima. Células BMDM de camundongos C57BL/6 sem ativação prévia por LPS, tiveram um resultado interessante. Nessa condição, foi observado que vermelho de rutênio e HC300031, antagonistas de TRPs, poderiam diminuir significativamente a permeabilização de membrana evocada por 5 mM de ATP. Entretanto, quando tratadas com LPS durante 4 horas, esta associação de drogas foi tóxica para as células (n = 3). Além disso, carbenoxolone 10 uM, antagonista de conexinas, foi capaz de diminuir a absorção de corante induzida por ATP 5 mM em células J774. Em virtude dos resultados obtidos, concluímos que o P2X7R ativado por ATP extracelular desencadeia o recrutamento de uma série de proteínas, sugerindo que Conexinas e TRPs poderiam estar participando da formação do poro associado ao P2X7R.