Padronização da triagem de alto desempenho de antagonistas para receptores purinérgicos ativados por UTP a partir da mensuração de cálcio intracelular

• Autor(a) principal: Ferreira, Natiele Carla da Silva
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14064
• topic: Receptores Purinérgicos P2Y; Triagem; Antagonistas Purinérgicos; Produtos Biológicos

Os receptores purinérgicos são proteínas expressas na membrana plasmática de diversos tipos celulares e são ativadas por purinas e pirimidinas extracelulares. Eles são classificados em receptores P1 e P2, de acordo com o tipo de ligante fisiológico, entretanto, os P2R são ainda subdivididos nas classes: P2XR, que abrange os subtipos ionotrópicos e P2YR, que agrupa os subtipos acoplados à proteína G. Dentre os P2YR, os subtipos P2Y2 e P2Y4 vem sendo amplamente estudados em virtude de suas funções sobre diversos sistemas biológicos. Uma vez ativados pelo UTP, estes receptores promovem a ativação e inibição de canais iônicos, controlam o fluxo de íons através da membrana, induzem um aumento de cálcio intracelular, além de estimular a proliferação celular. Em vista disso, muitos grupos de pesquisa já vem estudando o P2Y2 e o P2Y4 como alvos terapêuticos para o tratamento de diversas doenças, tais como fibrose cística, doença do olho seco, doença de Alzheimer, entre outras. Entretanto, a escassez de moléculas com propriedade antagonista seletiva sobre estes receptores dificulta o avanço da caracterização de novos papéis funcionais associados a eles, e neste contexto, os produtos naturais podem atuar como uma importante fonte para a descoberta de compostos que apresentem a característica almejada Por isso, o objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia de mensuração de cálcio intracelular induzido pelo UTP em células da linhagem de macrófagos murinos J774.G8 e realizar a triagem de extratos oriundos de produtos naturais a fim de identificar compostos com atividade antagonista sobre o P2Y2R e o P2Y4R. Para isso, foi padronizado um protocolo de carregamento celular com o indicador de cálcio Fluo-4AM com posterior leitura dos sinais de cálcio no FlexStation III em células J774.G8. A partir desta padronização foi realizada a caracterização dos subtipos de receptores P2 expressos nestas células que possuem vias de sinalização que aumentam o cálcio intracelular, além da triagem de 78 extratos de origem natural para averiguar a sua atividade antagonista sobre receptores P2YR ativados por UTP. Nesta triagem, identificamos 7 extratos com atividade antagonista sobre o aumento de cálcio induzido pelo UTP e que não demonstraram citotoxicidade após o tratamento de 15 e 60 minutos. Com isso, acreditamos que essa metodologia seja capaz de identificar novos antagonistas para estes receptores, o que irá contribuir significativamente para o campo de Farmacologia de Receptores Purinérgicos