Avaliação da Nested PCR em único tubo colorimétrica em diferentes amostras biológicas de pacientes com tuberculose
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Data de Publicação: | 2017 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23682 |
Resumo: | A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa com altas taxas de morbimortalidade no mundo. Seu diagnóstico é difícil e possui limitações, sobretudo nas formas paucibacilares. A reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada como auxiliar no diagnóstico da TB, por ser mais rápida, ter alta sensibilidade e especificidade. A Nested PCR em único tubo (STNPCR) é mais sensível, tem menor risco de contaminação cruzada e permite a identificação do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) diretamente de amostras clínicas. A STNPCR colorimétrica é um sistema molecular rápido, de fácil execução e interpretação. O objetivo deste trabalho foi definir os parâmetros da STNPCR colorimétrica automatizada em diferentes amostras biológicas de pacientes com TB. Foram analisadas 98 amostras de plasma, 100 de células mononucleares do sangue periférico (do inglês, peripheral blood mononuclear cells - PBMC), 95 de urina, 20 de escarro e 5 de líquido pleural. O DNA foi extraído e submetido à STNPCR, que teve como alvo a sequência de inserção IS6110. Foram usados dois pares de primers: TJ3 e TJ5; OLI 5 e STAN 3. O OLI 5 teve adicionado à sua porção 5’ uma biotina. Para a reação colorimétrica, utilizou-se uma sonda específica. Os resultados mostraram um limite de detecção do DNA de 1pg/μL em água Milli-Q®, 1fg/μL em urina, 10pg/μL em sangue (no plasma e PBMC), 1fg/μL em líquido pleural e 1fg/μL em escarro. O valor do cut off foi 0,092 em urina, 0,110 em plasma, 0,090 em PBMC, 0,081 em líquido pleural e 0,164 em escarro. A sensibilidade variou de 55,5% em plasma a 75,0% em líquido pleural. A especificidade variou de 51,5% em urina a 100% em líquido pleural. O índice Kappa entre a detecção colorimétrica e o gel de agarose foi substancial no escarro. Embora a sensibilidade e especificidade tenham tido grande variação, a técnica pode ser eficaz para auxiliar o diagnóstico da TB. Para a validação dos resultados, é necessário analisar um maior número de amostras biológicas. |
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Salazar, Marcela PereiraMonteiro, Juliana Figueirêdo da Costa Lima SuassunaSchindler, Haiana CharifkerMontenegro, Sílvia Maria LucenaLima, Andrea SantosSchindler, Haiana Charifker2017-12-20T14:03:38Z2017-12-20T14:03:38Z2017SALAZAR, Marcela Pereira. Avaliação da Nested PCR em único tubo colorimétrica em diferentes amostras biológicas de pacientes com tuberculose. 2017. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde Pública) – Instituto Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2017.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23682A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa com altas taxas de morbimortalidade no mundo. Seu diagnóstico é difícil e possui limitações, sobretudo nas formas paucibacilares. A reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada como auxiliar no diagnóstico da TB, por ser mais rápida, ter alta sensibilidade e especificidade. A Nested PCR em único tubo (STNPCR) é mais sensível, tem menor risco de contaminação cruzada e permite a identificação do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) diretamente de amostras clínicas. A STNPCR colorimétrica é um sistema molecular rápido, de fácil execução e interpretação. O objetivo deste trabalho foi definir os parâmetros da STNPCR colorimétrica automatizada em diferentes amostras biológicas de pacientes com TB. Foram analisadas 98 amostras de plasma, 100 de células mononucleares do sangue periférico (do inglês, peripheral blood mononuclear cells - PBMC), 95 de urina, 20 de escarro e 5 de líquido pleural. O DNA foi extraído e submetido à STNPCR, que teve como alvo a sequência de inserção IS6110. Foram usados dois pares de primers: TJ3 e TJ5; OLI 5 e STAN 3. O OLI 5 teve adicionado à sua porção 5’ uma biotina. Para a reação colorimétrica, utilizou-se uma sonda específica. Os resultados mostraram um limite de detecção do DNA de 1pg/μL em água Milli-Q®, 1fg/μL em urina, 10pg/μL em sangue (no plasma e PBMC), 1fg/μL em líquido pleural e 1fg/μL em escarro. O valor do cut off foi 0,092 em urina, 0,110 em plasma, 0,090 em PBMC, 0,081 em líquido pleural e 0,164 em escarro. A sensibilidade variou de 55,5% em plasma a 75,0% em líquido pleural. A especificidade variou de 51,5% em urina a 100% em líquido pleural. O índice Kappa entre a detecção colorimétrica e o gel de agarose foi substancial no escarro. Embora a sensibilidade e especificidade tenham tido grande variação, a técnica pode ser eficaz para auxiliar o diagnóstico da TB. Para a validação dos resultados, é necessário analisar um maior número de amostras biológicas.Tuberculosis (TB) is an infectious disease with high morbidity and mortality rates in the world. Its conventional diagnosis is difficult and has limitations, especially in paucibacillary forms. Polymerase chain reaction (PCR) has been used as an aid in the diagnosis of TB, because it is faster, has high sensitivity and specificity. Single Tube Nested PCR (STNPCR) has been shown to be more sensitive, offers a lower risk of cross-contamination and allows the identification of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) directly from clinical samples. Colorimetric STNPCR is a fast molecular system, easy to perform and interpret. The objective of this work was to define the parameters of automated colorimetric STNPCR from biological samples of TB patients. 98 samples of plasma, 100 samples of peripheral blood mononuclear cells - PBMC, 95 samples of urine, 20 samples of sputum and 5 samples of pleural fluid were analyzed. The DNA was extracted and submitted to STNPCR, which targeted the insertion sequence IS6110. Two pairs of primers were used: TJ3 and TJ5; OLI 5 and STAN 3. OLI 5 had added in its 5 'portion a biotin. For the colorimetric reaction, a specific probe was used. The results showed a DNA detection limit of 1pg/μl in Milli-Q® water, 1 μg/μl in urine, 10 μg/μl in blood (both in plasma and PBMC), 1 μg/μl in pleural fluid and 1 μg/μl in sputum. The cut off value was 0.092 in urine, 0.110 in plasma, 0.090 in PBMC, 0.081 in pleural fluid and 0.164 in sputum. The sensitivity ranged from 55.5% in plasma to 75.0% in pleural fluid. The specificity varied from 51.5% in urine to 100% in pleural fluid. The kappa between colorimetric detection and agarose gel was substantial in the sputum. It is concluded that, although the sensitivity and specificity vary greatly, it may be useful for the diagnosis of TB. To validate the results, it is necessary to analyze a larger number of biological samples.2018-07-12Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil.porTuberculoseTécnicas de diagnóstico molecularReação em cadeia da polimeraseTuberculosisMolecular diagnostic techniquesPolimerase chain reactionTuberculoseDiagnósticoTécnicas de diagnóstico molecularEstudos de Casos e ControlesReação em cadeia da polimerasemétodosTuberculosemicrobiologiaMycobacterium tuberculosisisolamento & purificaçãoEscarromicrobiologiaDNA BacterianoAnáliseSensibilidade e EspecificidadeAvaliação da Nested PCR em único tubo colorimétrica em diferentes amostras biológicas de pacientes com tuberculoseEvaluation of colorimetric single tube Nested PCR in different biological samples of patients with tuberculosisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2017-05-30Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Aggeu Magalhães.Mestrado AcadêmicoRecife/PEPrograma de Pós-Graduação em Saúde Públicainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-83092https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/23682/1/license.txt447f2497af1ef5cf99b5c07f6fa18dceMD51ORIGINALDissertação Marcela VERSÃO FINAL 07_07_17 (1).pdfDissertação Marcela VERSÃO FINAL 07_07_17 (1).pdfapplication/pdf1705119https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/23682/2/Disserta%c3%a7%c3%a3o%20Marcela%20VERS%c3%83O%20FINAL%2007_07_17%20%281%29.pdf065b8f7be9b84e98ef1a7565e1fc114dMD52TEXTDissertação Marcela VERSÃO FINAL 07_07_17 (1).pdf.txtDissertação Marcela VERSÃO FINAL 07_07_17 (1).pdf.txtExtracted 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