Avaliação da Nested PCR em único tubo colorimétrica em diferentes amostras biológicas de pacientes com tuberculose

• Autor(a) principal: Salazar, Marcela Pereira
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23682
• topic: Tuberculose; Técnicas de diagnóstico molecular; Reação em cadeia da polimerase; Tuberculosis; Molecular diagnostic techniques; Polimerase chain reaction; Tuberculose; Diagnóstico; Técnicas de diagnóstico molecular; Estudos de Casos e Controles; Reação em cadeia da polimerase; métodos; Tuberculose; microbiologia; Mycobacterium tuberculosis; isolamento & purificação; Escarro; microbiologia; DNA Bacteriano; Análise; Sensibilidade e Especificidade

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa com altas taxas de morbimortalidade no mundo. Seu diagnóstico é difícil e possui limitações, sobretudo nas formas paucibacilares. A reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada como auxiliar no diagnóstico da TB, por ser mais rápida, ter alta sensibilidade e especificidade. A Nested PCR em único tubo (STNPCR) é mais sensível, tem menor risco de contaminação cruzada e permite a identificação do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) diretamente de amostras clínicas. A STNPCR colorimétrica é um sistema molecular rápido, de fácil execução e interpretação. O objetivo deste trabalho foi definir os parâmetros da STNPCR colorimétrica automatizada em diferentes amostras biológicas de pacientes com TB. Foram analisadas 98 amostras de plasma, 100 de células mononucleares do sangue periférico (do inglês, peripheral blood mononuclear cells - PBMC), 95 de urina, 20 de escarro e 5 de líquido pleural. O DNA foi extraído e submetido à STNPCR, que teve como alvo a sequência de inserção IS6110. Foram usados dois pares de primers: TJ3 e TJ5; OLI 5 e STAN 3. O OLI 5 teve adicionado à sua porção 5’ uma biotina. Para a reação colorimétrica, utilizou-se uma sonda específica. Os resultados mostraram um limite de detecção do DNA de 1pg/μL em água Milli-Q®, 1fg/μL em urina, 10pg/μL em sangue (no plasma e PBMC), 1fg/μL em líquido pleural e 1fg/μL em escarro. O valor do cut off foi 0,092 em urina, 0,110 em plasma, 0,090 em PBMC, 0,081 em líquido pleural e 0,164 em escarro. A sensibilidade variou de 55,5% em plasma a 75,0% em líquido pleural. A especificidade variou de 51,5% em urina a 100% em líquido pleural. O índice Kappa entre a detecção colorimétrica e o gel de agarose foi substancial no escarro. Embora a sensibilidade e especificidade tenham tido grande variação, a técnica pode ser eficaz para auxiliar o diagnóstico da TB. Para a validação dos resultados, é necessário analisar um maior número de amostras biológicas.