Desenvolvimento de protocolo de PCR em tempo real para monitoramento da carga viral de cmv em pacientes pós-transplante renal

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cruz, Fernanda Baptista Caetano Pires da
Data de Publicação: 2017
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/28626
Resumo: Introdução: O citomegalovírus (CMV) é um vírus que circula de forma assintomática na população, com prevalência de até 90%. Após a infecção primária, permanece no organismo sob a forma latente, podendo ser reativado em situações de imunossupressão, como em pacientes transplantados renais. Nesses, a reativação é importante causa de mortalidade e morbidade, podendo levar à perda do órgão transplantado. Há uma correlação entre carga viral e prognóstico nesses indivíduos, sendo necessário o uso de técnicas que possibilitem o seu monitoramento, aprimorando a sensibilidade e rapidez do diagnóstico. A técnica de PCR em Tempo Real (qPCR) apresenta benefícios em relação às técnicas diagnósticas usualmente aplicadas. Justificativa: O monitoramento da infecção pelo CMV nesses pacientes afeta diretamente a intervenção a ser realizada, pois uma diminuição no uso de imunossupressores administrados pode levar a uma rejeição do enxerto, enquanto que o aumento poderá agravar o quadro infeccioso. Além disso, através da carga viral é possível: a identificação do risco de desenvolvemento de infecção ativa, avaliação da resposta terapêutica e reconhecimento de resistência à drogas. A qPCR é uma técnica que atende à essa necessidade, pois além de monitorar a carga viral, possui uma alta sensibilidade, detectando o vírus em estágios iniciais. Objetivos: O objetivo desse trabalho foi desenvolver um protocolo de baixo custo de padronização da técnica de qPCR baseada na metodologia SYBR Green, para diagnóstico da infecção pelo CMV em pacientes transplantados renais Métodos: Inicialmente foi desenvolvida e otimizada uma Nested PCR, avaliando-se a melhor temperatura de anelamento, para a amplificação do fragmento de CMV utilizando-se primers específicos para a região dos genes iniciais imediatos do vírus. Em seguida, foi realizada a clonagem do fragmento viral, utilizando bactérias competentes e a seleção das bactérias transformadas foi feita através da técnica de \201Cblue/whitescreening\201D. O clone foi utilizado para a obtenção e padronização da curva de qPCR, e em seguida aplicamos o protocolo em 9 amostras de plasma de pacientes, confrontado os resultados com os obtidos usando um kit comercial. Resultados: Através da otimização da Nested PCR, observou-se que a melhor temperatura de anelamento para os primers internos é de 57\02DAC. A amplificação de amostras de DNA isoladas do plasma de pacientes sabidamente positivos apresentaram resultado positivo, gerando fragmento de \2245 150 pb. A PCR após a transformação das bactérias gerou um fragmento de \2245 150 pb, conforme o esperado, mostrando sucesso da clonagem. O sequenciamento do clone revelou que 100% (query cover) da sequência apresentou 99% de similaridade com Herpes Virus-5 Humano (HHV-5). A reação de qPCR apresentou eficiência de 115,95% e R2=0,996, valores que demonstram que o teste oferece alta sensibilidade e permite a detecção de amostras até diluição de 10-5ng/mL. A análise da curva de Melting mostrou que os primers escolhidos são específicos para CMV. Além disso, os resultados foram concordantes com os obtidos pelo kit comercial. Conclusão: O protocolo desenvolvido é um método específico, sensível e de baixo custo. O mesmo se mostrou promissor no contexto do monitoramento dos pacientes no período pós-transplante renal, porém ainda necessita de maior validação.
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spelling Cruz, Fernanda Baptista Caetano Pires daMadeira, Maria de FátimaToma, Helena Keiko2018-09-11T12:46:37Z2018-09-11T12:46:37Z2017CRUZ, Fernanda Baptista Caetano Pires da. Desenvolvimento de protocolo de PCR em tempo real para monitoramento da carga viral de cmv em pacientes pós-transplante renal. 2017. 69 f. Dissertação (Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas)-Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/28626Introdução: O citomegalovírus (CMV) é um vírus que circula de forma assintomática na população, com prevalência de até 90%. Após a infecção primária, permanece no organismo sob a forma latente, podendo ser reativado em situações de imunossupressão, como em pacientes transplantados renais. Nesses, a reativação é importante causa de mortalidade e morbidade, podendo levar à perda do órgão transplantado. Há uma correlação entre carga viral e prognóstico nesses indivíduos, sendo necessário o uso de técnicas que possibilitem o seu monitoramento, aprimorando a sensibilidade e rapidez do diagnóstico. A técnica de PCR em Tempo Real (qPCR) apresenta benefícios em relação às técnicas diagnósticas usualmente aplicadas. Justificativa: O monitoramento da infecção pelo CMV nesses pacientes afeta diretamente a intervenção a ser realizada, pois uma diminuição no uso de imunossupressores administrados pode levar a uma rejeição do enxerto, enquanto que o aumento poderá agravar o quadro infeccioso. Além disso, através da carga viral é possível: a identificação do risco de desenvolvemento de infecção ativa, avaliação da resposta terapêutica e reconhecimento de resistência à drogas. A qPCR é uma técnica que atende à essa necessidade, pois além de monitorar a carga viral, possui uma alta sensibilidade, detectando o vírus em estágios iniciais. Objetivos: O objetivo desse trabalho foi desenvolver um protocolo de baixo custo de padronização da técnica de qPCR baseada na metodologia SYBR Green, para diagnóstico da infecção pelo CMV em pacientes transplantados renais Métodos: Inicialmente foi desenvolvida e otimizada uma Nested PCR, avaliando-se a melhor temperatura de anelamento, para a amplificação do fragmento de CMV utilizando-se primers específicos para a região dos genes iniciais imediatos do vírus. Em seguida, foi realizada a clonagem do fragmento viral, utilizando bactérias competentes e a seleção das bactérias transformadas foi feita através da técnica de \201Cblue/whitescreening\201D. O clone foi utilizado para a obtenção e padronização da curva de qPCR, e em seguida aplicamos o protocolo em 9 amostras de plasma de pacientes, confrontado os resultados com os obtidos usando um kit comercial. Resultados: Através da otimização da Nested PCR, observou-se que a melhor temperatura de anelamento para os primers internos é de 57\02DAC. A amplificação de amostras de DNA isoladas do plasma de pacientes sabidamente positivos apresentaram resultado positivo, gerando fragmento de \2245 150 pb. A PCR após a transformação das bactérias gerou um fragmento de \2245 150 pb, conforme o esperado, mostrando sucesso da clonagem. O sequenciamento do clone revelou que 100% (query cover) da sequência apresentou 99% de similaridade com Herpes Virus-5 Humano (HHV-5). A reação de qPCR apresentou eficiência de 115,95% e R2=0,996, valores que demonstram que o teste oferece alta sensibilidade e permite a detecção de amostras até diluição de 10-5ng/mL. A análise da curva de Melting mostrou que os primers escolhidos são específicos para CMV. Além disso, os resultados foram concordantes com os obtidos pelo kit comercial. Conclusão: O protocolo desenvolvido é um método específico, sensível e de baixo custo. O mesmo se mostrou promissor no contexto do monitoramento dos pacientes no período pós-transplante renal, porém ainda necessita de maior validação.Introduction: Cytomegalovirus (CMV) is a pathogen that normally circulates asymptomatically among population, reaching a prevalence of up to 90%. After primary infection normally asymptomatic, virus can remain latent, and can be reactivated in immunosuppressive situations such as in renal transplanted patients. In these patients, viral reactivation is an important cause of mortality and morbidity, and may lead to graft loss in some cases. Viral load is an important parameter in prognosis and follow-up of these individuals. Therefore, it is necessary to use techniques that can perform virus monitoring, aiming for an improvement in sensitivity and rapidity in diagnosis. Real Time PCR (qPCR) has been shown to be effective in monitoring the viral load of these patients, presenting several benefits in relation to others techniques. The diagnosis and monitoring of CMV infection on these patients will directly affect the intervention, since a drastic decrease in the usage of immunosuppressants administered may lead to rejection of the transplanted organ, whereas an increase may be harmful for the infectious condition. In addition, quantification of viral load in plasma is extremely important on those patients since it allows: identification of patients who are at increased risk of developing active virus infection, evaluation of therapeutic response and recognition of drug resistance. Thus, real-time PCR is a technique that meets this needs since, it has high sensitivity, allows the detection of virus at the initial stage of infection and can also provide the viral load monitoring Aim: The aim of this study is to develop a protocol of Real Time PCR using Sybr Green® for the diagnosis and monitoring of CMV infection in renal transplant patients. Methods: Initially, a Nested PCR was developed and optimized to evaluate the best annealing temperature for amplification of the CMV fragment using primers specific to immediate early genes region. Then, the viral fragment was cloned using competent bacteria and the selection of the transformed bacteria was done by "blue / whitescreening" technique. The clone was used to obtain the qPCR standart curve. Results: Nested PCR optimization showed that the best annealing temperature for internal primers was 57\02DAC, and amplification of DNA samples isolated from the plasma of well-known patients showed a positive result, generating a fragment of \2245 150 bp. PCR after transformation of the bacteria generated a fragment of \2245 150 bp, as expected, showing success in the procedure. Sequencing of the clone revealed that 100% (query cover) of the sequence showed 99% similarity with Human Virus-5 Herpesvirus (CMV). qPCR reaction showed efficiency of 115,95% and R2=0,996, values that demonstrate that the test offers high sensitivity and allows the quantification of samples with the precision of up to 10-5ng/ml. Also, the metilng curve analysis showed that our primer set is specific for CMV. Conclusion: Our method is a specific, low cost method and effective to diagnose and monitor CMV infection in post- renal transplanted patients.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porCitomegalovírusCarga ViralReação em Cadeia da Polimerase em Tempo RealTransplante de RimDesenvolvimento de protocolo de PCR em tempo real para monitoramento da carga viral de cmv em pacientes pós-transplante renalinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2017Instituto Nacional de Infectologia Evandro ChagasFundação Oswaldo CruzRio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosasinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/28626/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINALfernanda_cruz_ini_mest_2017.pdfapplication/pdf2035780https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/28626/2/fernanda_cruz_ini_mest_2017.pdf39648d10fe2319d25ba2e90c94e0e77aMD52TEXTfernanda_cruz_ini_mest_2017.pdf.txtfernanda_cruz_ini_mest_2017.pdf.txtExtracted texttext/plain108455https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/28626/3/fernanda_cruz_ini_mest_2017.pdf.txt46c96538c1da1feb1fb12b87997c799eMD53icict/286262018-09-12 02:01:11.958oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352018-09-12T05:01:11Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false
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