Construction of yellow fever virus subgenomic replicons by yeast-based homologous recombination cloning technique

• Autor(a) principal: Queiroz, Sabrina R. A.
• Data de Publicação: 2013
• Outros Autores: Silva, Andréa N. M. R., Santos, Jefferson J. S., Marques, Ernesto T. A., Bertani, Giovani R., Gil, Laura H. V. G.
• Tipo de documento: Artigo
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• DOI: 10.1590/S0001-37652013005000008
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23659
• topic: técnica de clonagem; recombinação homóloga; replicon; gene repórter; vírus da febre amarela; cloning technique; homologous recombination; replicon; reporter gene; yellow fever virus; Clonagem Molecular; Humanos; Recombinação Genética; genética; Genes Reporter; genética; Replicon; genética; Vírus da Febre Amarela; genética; RNA Viral; genética; Vírus da Febre Amarela; fisiologia; Replicação Viral

O replicon de RNA derivado do genoma de Flavivirus é uma ferramenta valiosa para o estudo de replicação viral independente da montagem e da maturação do virion, além de possuir um grande potencial para expressão de genes heterólogos. Neste estudo nós descrevemos a construção de replicons subgenômicos do vírus da febre amarela utilizando a técnica de recombinação homóloga em levedura. O plasmídeo contendo o replicon do vírus febre amarela cepa 17D (pBSC-repYFV-17D), caracterizado anteriormente, foi manipulado para a expressão heteróloga dos genes repórteres green fluorescent protein (repYFV-17D-GFP) e firelly luciferase (repYFV-17D-Luc). Ambos os replicons foram construídos por recombinação homóloga entre o vetor pBSC-repYFV-17D linearizado e o produto de PCR contendo 25 nucleotídeos terminais homólogos incorporados aos oligonucleotídeos iniciadores. A organização genômica dos construídos é semelhante ao repYFV-17D, com inserção de um gene repórter entre os restantes 63 nucleotídeos N-terminais da proteína do capsídeo e 72 nucleotídeos C-terminais da proteína E. Os replicons repYFV-17D-GFP e repYFV-17D-Luc mostraram uma eficiente replicação e expressão dos genes repórteres. A técnica de recombinação homóloga em levedura usada neste estudo demonstrou ser aplicável à manipulação do genoma do vírus da febre amarela para a construção de replicons subgenômicos.