Desenvolvimento de método molecular em plataforma Lab-on-a-chip para diagnóstico de micro-organismos associados à sepse

• Autor(a) principal: Carvalho, Taís Franco de
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32858
• topic: Hemocultura; Sepsis; Systemic Inflammatory Response Syndrome; Blood Culture; Polymerase Chain Reaction; Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica; Cultivo de Sangre; Reacción en Cadena de la Polimerasa; Sepse; Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica; Reação em Cadeia da Polimerase

Sepse é a disfunção múltipla de órgãos causada pela resposta inflamatória desregulada do corpo a uma infeção. É a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva no mundo, o que é associado a falta de diagnóstico e tratamento eficiente e no tempo adequado. Hemocultura é o padrão ouro para diagnóstico de infecções da corrente sanguínea. No entanto, ela demanda de 3 a 7 dias para o resultado final. A administração de antimicrobianos antes da coleta de amostras de sangue e o crescimento fastidioso de certos patógenos também tornam esse método não apropriado para guiar a terapia de forma correta. Logo, avanços têm sido feitos em biologia molecular para oferecer alternativas mais rápidas e sensíveis. De acordo com a literatura, testes baseados em PCR diretamente do sangue total são considerados os mais promissores dentre eles. Desenvolvemos nesse projeto um multiteste PCR/Arranjo que alia a amplificação por PCR com hibridização de ácidos nucleicos em Lab-on-a-chip (In-CheckTM platform, STMicroelectronics). Os micro-organismos cobertos no painel foram selecionados de acordo com dados epidemiológicos nacionais. Sequências do genoma destes micro-organismos foram obtidas de bancos de dados e sequenciamentos e alinhadas para o desenho de iniciadores e sondas. Iniciadores foram gerados para reconhecer e amplificar regiões conservadas com variação interna onde as sondas foram desenhadas para detectar e diferenciar cada espécie. Para avaliar e otimizar iniciadores e sondas assim como o protocolo de PCR e de hibridização, foi utilizado DNA extraído de patógenos em cultivo previamente caracterizados com metodologias tradicionais de microbiologia e sequenciamento. Especificidade e sensibilidade analítica foram investigadas usando DNA extraído de sangue artificialmente contaminado com concentrações conhecidas de micro-organismos. O protótipo final identifica 22 espécies de bactérias e 5 espécies de Candida spp. Adicionalmente, sondas universais diferenciam bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e o gênero Candida. O limite de detecção do teste é de 10 a 1000 UFC/mL, o que tem valor clínico considerando concentrações de bactéria reportadas em sangue periférico de pacientes sépticos. O teste pode prover a detecção mais rápida e precisa de agentes causadores de sepse, permitindo tratamento mais eficiente antes da progressão para choque séptico e potencialmente contribuindo para reduzir taxa de mortalidade. Também promove uso consciente de antimicrobianos, reduzindo seleção de cepas resistentes.