Avaliação de assinaturas gênicas em pacientes com febre amarela para identificação de biomarcadores de prognóstico

• Autor(a) principal: Dutra, Isabela Thamara Sabino
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/55283
• topic: Febre amarela; hepatite de recidiva tardia; biomarcadores de prognóstico; yellow fever; late-relapsing hepatitis; prognostic biomarkers; Febre amarela; Hepatite; Expressão gênica; Prognóstico; Biomarcadores

A febre amarela é uma doença hemorrágica, causada por um arbovírus do gênero Flavivirus, acometendo cerca de 200 mil pessoas anualmente em mais de 40 países, incluindo o Brasil. Entre 2016 e 2018 houve importantes surtos da doença, acometendo mais de duas mil pessoas, principalmente na região sudeste do país. Também foi relatado que alguns pacientes apresentaram quadro de hepatite de recidiva tardia após melhora clínica e laboratorial, entre 40 e 70 dias após os sintomas iniciais, com presença do vírus confirmada em fragmento de biópsia hepática. Diante disso, o presente estudo buscou avaliar um painel de 44 genes envolvidos em vias de sinalização, no processo de ativação da coagulação, no reconhecimento de produtos imunogênicos, em eventos hemorrágicos e nas funções de imunidade inata, inflamassoma e apoptose, em pacientes curados e pacientes que apresentaram hepatite de recidiva tardia, a fim de se correlacionar os perfis de expressão desses genes com o prognóstico da doença. Primeiramente, foram realizadas padronizações de extrações de RNA, definindo protocolos que priorizam maiores rendimentos de RNA na extração. Assim, as amostras processadas por Cell strainer apresentaram maior rendimento pelo método do TRIzol™ Reagent e para as amostras armazenadas como fragmentos de coágulo ficou estabelecida a utilização apenas do TRIzol™ Reagent em contato com a superfície dos fragmentos. Para a síntese de cDNA, o melhor desempenho foi do Kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription; e para as extrações de DNA, o kit QIAamp® DNA Blood Mini. Foram obtidas e utilizadas em extrações de RNA e/ou DNA, 124 amostras de pacientes do surto de 2017-2018, divididas em: pacientes que apresentaram febre amarela e foram efetivamente curados, amostras coletadas no período de 07 a 15 dias (FA 07-15d), 16 a 35 dias (FA 16-35d), e 61 a 90 dias após início dos sintomas (FA 61-90d); e pacientes que apresentaram hepatite de recidiva tardia, amostras coletadas no período de 07 a 15 dias (Hep 07-15d), 16 a 35 dias (Hep 16-35d) e 61 a 90 dias após início dos sintomas (Hep 61-90d). Foram realizados ensaios TaqMan® Array Cards com RNAs de 80 amostras. Foram utilizados como genes de referência os transcritos de GAPDH e ACTB por serem expressos de forma mais estável nas amostras analisadas. As análises estatísticas foram realizadas com os valores de 2-ΔCrt. Os marcadores CASP3, CASP8, CXCR1, IL18, MAPK3, FAS e FCGRT foram diferencialmente expressos entre os indivíduos que apresentaram febre amarela e foram efetivamente curados, nos períodos 07-15d e 16-35d, quando comparado com indivíduos que apresentaram hepatite de recidiva tardia, nos mesmos períodos. A análise de assinaturas ascendentes de biomarcadores mostrou que IL18, TNFRSF1A, CXCL2, CASP3, e IL6, envolvida em reparo de danos hepáticos, são mais frequentes no grupo FA 16-35d, enquanto IL27 é mais frequente no grupo Hep 07-15d, indicando que esses genes podem ser possíveis biomarcadores de prognóstico para a hepatite de recidiva tardia. A via de resposta imunológica do papel da PKR na resposta celular antiviral induzida por estresse é a mais representativa que engloba os genes selecionados para o estudo (CASP3, CASP8, IFNA2, IFNB1, IFNG, IL6, IL10, MAPK1, MAPK3, NFKB1, TLR3 e TNFRSF1A).