Expressão de proteínas RAP1 recombinantes e produção de anticorpos anti- RAP1: potencial uso como biomarcador no diagnóstico de tumores

• Autor(a) principal: Gonçalves, Carolina de Souza
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/9945
• topic: Neoplasias do colo de útero; Imunohistoquímica; Proteínas rap de Ligação ao GTP/uso diagnóstico

Alterações imunofenotípicas qualitativas e quantitativas na expressão da proteína RAP1, uma pequena GTPase da superfamília RAS, estão presentes em diversos tipos de cânceres, tais como carcinomas de células escamosas de orofaringe, câncer papilar da tireóide, câncer de mama, carcinoma de células renais, leucemia, melanoma, neoplasias intraepiteliais e câncer cervical. Entretanto, para a utilização de RAP1 como biomarcador para auxiliar no diagnóstico imuno-histoquímico de tumores, especialmente do câncer cervical, são necessários anticorpos anti-RAP1 a baixo custo, uma vez que, atualmente, os anticorpos disponíveis no Brasil são importados e de custo elevado, tornando inviável sua utilização no diagnóstico de rotina. Assim, este trabalho tem como objetivos a expressão de proteínas RAP1 recombinantes (rRAP1) em sistema bacteriano, e a produção de anticorpos monoclonais e policlonais anti-rRAP1, visando a sua aplicação no diagnóstico de diversos tumores por imuno-histoquímica. Dois genes RAP1 sintéticos codificantes para as proteínas rRAP1A e rRAP1AB foram desenhados, sintetizados e subclonados no plasmídeo de expressão bacteriano pQE9 e sua expressões obtidas na linhagem hospedeira E.coli M15. Após indução com IPTG, as proteínas rRAP1 foram purificadas por cromatografia líquida em coluna de afinidade de quelato de níquel, obtendo-se o rendimento, por litro de cultura bacteriana, de 185,6 mg/L de rRAP1A e 103,9 mg/L de rRAP1AB. As proteínas rRAP1 purificadas foram inoculadas em animais para a produção de anticorpos monoclonais e policlonais anti-rRAP1A e antirRAP1AB. Ensaios imuno-histoquímicos foram realizados em tecidos de pacientes com neoplasia cervical para a avaliação da reatividade dos anticorpos anti-rRAP1 com a proteína RAP1 humana. Uma intensa imunorreatividade foi verificada com o anticorpo anti-rRAP1A (policlonal produzido em coelhos) considerado, até o momento, o melhor candidato para uso na detecção da expressão de RAP1 em ensaios imuno-histoquímicos, o que pode auxiliar no diagnóstico de várias neoplasias, especialmente, do câncer do colo uterino.