Quantificação de DNA de Trypanosoma cruzi em soro e potencial uso das 5 UTRs da família gênica de trans-sialidases para a genotipagem do parasito como complemento ao diagnóstico molecular da infecção

• Autor(a) principal: Melo, Myllena de Fátima Alheiros Dias
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14864
• topic: Trypanosoma cruzi; Reação em Cadeia da Polimerase; Regiões 5' não Traduzidas; Soro

Ensaios de PCR para o diagnóstico e monitoramento da carga parasitária em pacientes acometidos pela doença de Chagas são realizados a partir de DNA recuperado de sangue periférico. Uma perspectiva seria a possibilidade do uso de soro para a detecção e quantificação de DNA de T. cruzi, aproveitando amostras coletadas para triagem sorológica em laboratórios de referência e bancos de sangue. Outra limitação é que o diagnóstico molecular com os alvos mais comumente utilizados (kDNA, DNA Satélite) não é capaz de identificar as linhagens do parasito. Tem sido relatada uma baixa sensibilidade para alguns marcadores de genotipagem de T. cruzi quando aplicados diretamente em sangue de pacientes crônicos, uma vez que são cópias únicas ou distribuídos em baixa frequência no genoma do parasito. Estudos baseados em famílias multigênicas, como as proteínas de superfície (trans-sialidases), sugerem que estas sejam capazes de reunir cepas/isolados de T. cruzi em grupos biologicamente distintos, visando sua caracterização. A presença de sítios polimórficos nas regiões não traduzidas (UTRs) dos genes de trans-sialidases (TS), além de representar uma estratégia de sobrevivência do parasito ao estresse ambiental, propicia o uso destas regiões como potenciais marcadores moleculares para tipagem de T. cruzi. Este trabalho avaliou o potencial uso do soro e do segmento 5\2019 UTR de TS de T. cruzi, em ensaios de quantificação de DNA e genotipagem do parasito, respectivamente Neste sentido, empregamos a PCR em Tempo Real (qPCR) multiplex para a detecção/quantificação de T. cruzi em amostras pareadas de soro e sangue de 40 pacientes com a doença crônica. Para avaliar o uso da 5\2019 UTR de TS como marcador molecular de genotipagem, utilizamos um painel de cepas/clones de T. cruzi, representantes das seis DTUs (Unidades Discretas de Tipagem). Após amplificação do segmento contendo parte da 5\2019 UTR e uma porção da região codificante de TS das diferentes cepas/clones, e posterior sequenciamento por método capilar (SANGER), realizamos a análise composicional das sequências. Em seguida, novos iniciadores foram desenhados para os ensaios de COLD-PCR HRM (High Resolution Melting). Os resultados da qPCR revelaram sensibilidade de detecção de 95% e 97% para soro e sangue, respectivamente, e especificidade de 100% para ambos os tipos de amostras. As medianas de carga parasitária em soro e sangue, também não demonstraram diferenças significativas, sendo de 1,12 e 1,23 equivalentes parasito/mL, respectivamente, o que reproduz a baixa parasitemia observada nos pacientes com doença de Chagas crônica. A partir das análises composicionais das sequências de 5\2019 UTR de TS obtidas pelo método capilar, identificamos blocos conservados e sítios polimórficos entre as linhagens, porém não foi possível gerar assinaturas genômicas associadas à caracterização em DTUs. O sequenciamento New Generation Sequencing do segmento 5\2018 UTR de TS permitiu a caracterização das cepas/clones em seis DTUs, como demonstrado na árvore filogenética construída a partir de 4.568.225 sequências Os ensaios de COLD-PCR HRM, direcionados para diferentes seções do segmento 5\2019 UTR de TS, foram eficientes em agrupar cepas/clones em duas variantes, sugerindo uma associação com os ciclos de transmissão, virulência e evolução populacional destes parasitos. Os resultados gerados no presente estudo sugerem o uso de soro para o diagnóstico molecular da infecção pelo T. cruzi em laboratórios de referência, responsáveis pela manutenção de sorotecas, bem como demonstram o potencial discriminatório do alvo 5\2019 UTR de trans-sialidases para ser explorado em ensaios de genotipagem do parasito diretamente de amostras clínicas e biológicas, acoplado ao sequenciamento High Throughput dos produtos amplificados, como ferramenta complementar à pesquisa diagnóstica da doença de Chagas