Caracterização molecular de isolados de Blastocystis sp. de origem humana e animal

• Autor(a) principal: Barbosa, Carolina Valença
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/29694
• topic: Epidemiologia Molecular; Variação Genética; Reação em Cadeia da Polimerase; Epidemiologia Molecular; Variação Genética; Reação em Cadeia da Polimerase

Blastocystis sp. é considerado o parasito mais frequentemente encontrado no trato gastrointestinal humano. Elevados percentuais de prevalência são observados nos países em desenvolvimento, atingindo até 100%. Este parasito também tem sido isolado em aves, anfíbios, répteis, insetos e mamíferos. Análises moleculares parciais do gene SSU-RNAr evidenciaram a existência de 17 subtipos, dos quais 10 (ST1-ST9, ST12) são encontrados na população humana e de animais (exceto o ST9). Os demais subtipos são encontrados exclusivamente em animais. Atualmente, poucos estudos sobre a diversidade genética de Blastocystis sp. foram realizados no Brasil. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo caracterizar os isolados de Blastocystis sp. de origem humana e de animais e avaliar o desempenho das reações em cadeia da polimerase (PCR) com alvos dirigidos para regiões parciais do gene SSU-RNAr, espaçador transcrito interno 1-2 e para SSU-RNAr da organela mitocôndria-like na identificação dos subtipos de Blastocystis sp. Para tanto, foram utilizadas as técnicas de cultivo in vitro, PCR seguido de sequenciamento, PCR subtipo específico, ferramenta BLAST e análise filogenética. Um total de 848 amostras de fezes foram submetidas ao cultivo in vitro. Das 309 (194 de humanos e 115 de animais) amostras positivas na cultura, somente 241 foram amplificadas e sequenciadas por meio da PCR/sequenciamento para o alvo SSU-RNAr. Destas, 191 (139 humanos e 52 animais) sequências foram identificadas como os seguintes subtipos: ST1, ST2, ST4, ST5 e ST8 por meio da pesquisa pela ferramenta BLAST e pela análise filogenética. O ST de um isolado não foi identificado nas análises. Entre as demais sequências, 22 apresentaram picos sobrepostos no eletroferograma e 27 apresentaram uma baixa resolução Para a análise comparativa entre os alvos foram utilizadas 61 amostras previamente identificadas pelo alvo SSU-RNAr. Destas, foram obtidas 59 sequências para o alvo MLO-DNAr, das quais identificamos os ST1-5, ST7, ST8 e 27 para o alvo ITS1-2. Quando comparamos os resultados obtidos com os alvos SSU-RNAr e MLO-DNAr observamos que 17 isolados apresentaram resultados discordantes quanto à identificação dos STs. Além disso, 16 isolados foram caracterizados somente pelo MLO-DNAr, em decorrência da falta de êxito da PCR ou pela baixa resolução das sequências. Em relação ao alvo ITS1-2 não foi possível comparar os resultados, tendo em vista que existem apenas as sequências dos ST1-ST3 e ST7 depositadas no banco público de DNA. As sequências obtidas para este alvo servirão apenas para aumentar o banco dados. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a ocorrência de uma grande diversidade de subtipos de Blastocystis sp. na amostragem estudada, tanto em hospedeiros humanos quanto em animais. Quanto ao ST não identificado, recomenda-se o sequenciamento total do gene SSU-RNAr para confirmar a existência de um novo ST. O ST4 foi identificado pela primeira vez na população brasileira, bem como a identificação de STs em diferentes hospedeiros animais na amostragem analisada. Em relação a análise de variabilidade genética dos STs, foi possível observar que os ST1 e ST3 apresentaram a maior distância genética intra-subtipos, compreendendo 8% e quase 10%, respectivamente seguidos pelo ST2 com proximamente 5%. Os demais subtipos (ST4-ST9), a divergência genética foi inferior a 5%. Ao analisar as 17 cópias do gene 18S de um isolado do ST7 comparando as diferentes regiões que são utilizadas na literatura, verificamos que a variabilidade genética varia de 1 a 3,5%. Desta forma, este estudo contribui para compreensão da epidemiologia molecular e para a diversidade genética de Blastocystis sp. em escala regional e global.