Avaliação de protocolos de extração e purificação de DNA alvo da reação em cadeia da polimerase na detecção de Leishmania (Viannia) spp

• Autor(a) principal: Silva, Angélica Olivino da
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23758
• topic: Leishmaniose Tegumentar Americana; DNA; Reação em Cadeia da Polimerase; Diagnóstico; American cutaneous leishmaniasis; DNA; Polymerase Chain Reaction; Diagnosis; Leishmaniose Cutânea; Diagnóstico; Reação em Cadeia da Polimerase; métodos; Leishmania; genética; DNA de Protozoário; isolamento & purificaçäo; DNA de Protozoário; genética; Leishmania; isolamento & purificação; Sensibilidade e Especificidade; Reprodutibilidade dos Testes; Técnicas de Diagnóstico Molecular; Brasil

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma parasitose, de grande importância para saúde pública e que acomete pele e mucosas, causada por espécies distintas de protozoários do gênero Leishmania. A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), com sua elevada sensibilidade, constitui uma ferramenta valiosa para estudos clínicos e epidemiológicos em leishmanioses. Em ensaios de PCR é crucial que o DNA alvo esteja bem purificado, a fim de que o resultado seja fidedigno. A comparação entre protocolos para extração e purificação de DNA assegura uma análise mais aprofundada da eficiência de cada um, e pode levar ao desenvolvimento de técnicas mais específicas e sensíveis que complementadas com abordagens não invasivas de coleta constituiriam um relevante avanço para o diagnóstico molecular e para a pesquisa da leishmaniose. Neste estudo comparativo, inicialmente utilizamos como substratos à extração e purificação de DNA o material genético de promastigotas resultantes de cultura de Leishmania (V.) braziliensis e de swabs embebidos em diferentes diluições da referida cultura. Durante o estudo, avaliamos os protocolos testados (kit comercial, precipitação por cloreto de sódio, extração e purificação por fenol/clorofórmio e adsorção à sílica em suspensão) sob diferentes parâmetros. Entre eles podemos citar: rendimento da extração, grau de pureza do DNA extraído, reprodutibilidade, praticidade e relação custo/benefício do processo. Mesmo sendo um dos protocolos mais conhecidos, o protocolo de extração e purificação por fenol/clorofómio só obteve vantagem no parâmetro de grau de pureza do DNA extraído. Nos outros parâmetros analisados o protocolo que mais se destacou foi o de adsorção à sílica em suspensão, obtendo resultados estatisticamente significativos (p<0,05), gerando também os melhores resultados visuais no que diz respeito aos produtos de PCR. Recomendamos, portanto, que o protocolo de adsorção à sílica em suspensão venha a ser utilizado para o diagnóstico e pesquisa da LTA, em conjunção com o método de coleta por swab, usado como um método alternativo e/ou complementar às diversas técnicas já estabelecidas de coleta de amostras dos pacientes com suspeita da doença.