Purificação de β-galactosidase: design do processo

• Autor(a) principal: Lemes, Ailton Cesar
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FURG (RI FURG)
• Texto Completo: http://repositorio.furg.br/handle/1/6672
• topic: Sistema aquoso bifásico; Troca iônica; Ultrafiltração; Precipitação; Aqueous two-phase system; Ion exchange; Ultrafiltration; Precipitation

A β-galactosidase é uma enzima largamente encontrada na natureza, distribuída entre animais, vegetais e micro-organismos. É utilizada industrialmente na hidrólise da lactose de leite e derivados, principalmente em produtos destinados a pessoas que apresentam intolerância à lactose, ou seja, incapacidade de digerir a lactose pela deficiência ou ausência desta enzima. O aumento da demanda industrial de β-galactosidase implica na necessidade de métodos de produção que assegurem a viabilidade econômica da hidrólise de lactose em escala comercial. Portanto, tornamse fundamentais estudos que contemplem as etapas e a melhor sequência de purificação da enzima de modo a maximizar a pureza do processo sem prejuízos ao rendimento. Dessa forma é importante estabelecer os processos e designs de purificação e recuperação desta enzima. Este trabalho teve como objetivo avaliar a purificação de β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 através do estudo dos parâmetros de operação do sistema aquoso bifásico (SAB) e ultrafiltração, e estabelecer o melhor design para a purificação da enzima utilizando as técnicas de precipitação com sulfato de amônio, diafiltração, cromatografia de troca iônica, SAB e ultrafiltração. A presente dissertação foi dividida em três artigos. No primeiro artigo, o sistema aquoso bifásico foi estudado realizando uma varredura para seleção da massa molar de polietilenoglicol (PEG) (4000, 6000 e 8000) e o pH do sistema (6,0; 7,0 e 8,0) e posterior utilização da metodologia de superfície de resposta como uma ferramenta para identificar a composição do sistema capaz de maximizar o particionamento e purificação da enzima, avaliando-se a concentração do polímero e fosfato de potássio. Este processo de purificação mostrou-se eficiente, alcançando valores de fator de purificação e recuperação de 3,8 e 101,7%, respectivamente, quando o sistema foi composto por uma concentração de 14% de PEG 4000 e 15% de tampão fosfato de potássio no pH 7,0. O segundo artigo apresenta a concentração e purificação da enzima β-galactosidase por ultrafiltração, onde avaliou-se a influência do pH (6,5; 7,0 e 7,5), massa molar de corte das membranas (30; 50 e 60 kDa), pressão de operação (1,5; 2,0 e 2,5 kgf/cm²) e influência da força iônica (0,01; 0,05 e 0,1 M) na. A utilização da ultrafiltração para concentração e recuperação da enzima mostrou-se satisfatória alcançando valores de até 8,1 vezes e 112,7%, respectivamente. Para a β-galactosidase a ultrafiltração não foi tão eficiente para a purificação, pois alcançou baixos valores de fator de purificação. O aumento da pressão de operação e a adição de cloreto de sódio e potássio ocasionaram prejuízos ao rendimento e a purificação da enzima. O último artigo apresenta o estabelecimento do melhor design para purificação e recuperação da enzima através do uso das técnicas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, ultrafiltração, diafiltração e sistema aquoso bifásico em diferentes sequências. O design que apresentou o melhor fator de purificação global foi a sequência formada pelo sistema aquoso bifásico, diafiltração, cromatografia de troca iônica e ultrafiltração, fornecendo um fator de purificação global de 10,8 vezes e uma recuperação global de 41,3%. Dessa forma, foi possível estabelecer um design para purificação da enzima β- galactosidase passível de ampliação de escala (scale up).