Desenvolvimento de modelos animais de terapia genica para o hormonio de crescimento utilizando queratinocitos transduzidos e injecao direta de DNA plasmidial

• Autor(a) principal: OLIVEIRA, NELIO A. de J.
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Tese
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9604
• topic: sth; gene therapy; keratin; animal growth; dna; plasmids; mice; immunity

Queratin??citos s??o c??lulas bastante atrativas para a transfer??ncia g??nica ex vivo e libera????o sist??mica, uma vez que as prote??nas secretadas por estas c??lulas podem atingir a circula????o via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratin??citos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do horm??nio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de ader??ncia ao col??geno e ?? an??lise clonal, com o intuito de enriquecer esta popula????o de queratin??citos em c??lulas-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratin??citos tratados, que poder?? se refletir num aumento da durabilidade da secre????o do horm??nio in vivo, quando realizado o implante de culturas organot??picas em camundongos an??es imunodeficientes (lit/scid). Foi tamb??m utilizado um modelo de terapia g??nica in vivo, baseado na eletrotransfer??ncia de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do horm??nio de crescimento humano (hGH), no m??sculo quadr??ceps de camundongos an??es (lit/lit) e an??es imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condi????es de eletropora????o em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasm??deo com o promotor da ubiquitina C e a sequ??ncia gen??mica do hGH. A administra????o de uma dose ??nica de 50 g do plasm??deo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletropora????o, propiciou pela primeira vez na literatura obten????o de n??veis sustent??veis na circula????o de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, n??o significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletropora????o). Os m??sculos quadr??ceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransfer??ncia foi realizado comparando a utiliza????o da sequ??ncia gen??mica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasm??deos sob o controle do promotor de citomegalov??rus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circula????o de camundongos lit/scid, por um per??odo de 21 dias. Foram tamb??m constru??dos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que ser??o utilizados num pr??ximo estudo, tanto para a transdu????o de queratin??citos, como para a eletrotransfer??ncia in vivo. Vetores lentivirais ser??o de fato necess??rios para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em compara????o com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, t??m como meta estabelecer condi????es para que a terapia g??nica seja num futuro pr??ximo uma alternativa vi??vel e segura para o tratamento da defici??ncia de GH e de outras doen??as sist??micas.