Clonagem, caracteriza????o e an??lise filogen??tica das subunidades alfa e beta do horm??nio fol??culo estimulante de Pirarucu (Arapalma gigas) visando sua s??ntese em c??lulas CHO

• Autor(a) principal: CARVALHO, ROBERTO F. de
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11796
• topic: fishes; fsh; dna-cloning; genetics; chemical analysis; cho cells; polymerase chain reaction; rna

O Pirarucu (Arapaima gigas) ?? um peixe gigante da fam??lia Arapaimidae, nativo das bacias amaz??nicas que pode chegar a dois metros de comprimento e pesar mais de 200 Kg. Est?? presente no Equador, na Col??mbia, no Peru, na Bol??via e no Brasil. Atualmente a esp??cie est?? amea??ada de extin????o devido ?? pesca predat??ria e ao aumento da presen??a humana em seus viveiros naturais. No presente trabalho, os cDNAs da subunidade (ag-GTHα) e da subunidade β do horm??nio fol??culo estimulante de A. gigas (ag-FSH) foram isolados e clonados pela primeira vez, possibilitando uma melhor compreens??o da diversidade e evolu????o desta glicoprote??na em peixes e a futura s??ntese biotecnol??gica deste horm??nio para fins reprodutivos e aliment??cios. Tanto o cDNA do ag-GTHα quanto aquele do ag-FSHβ foram sintetizados pela rea????o de transcriptase reversa (RT) e pela rea????o em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde RNA total proveniente das gl??ndulas hipofis??rias de A. gigas. O cDNA da subunidade ag-GTHα possui uma sequ??ncia codificadora (Open Reading Frame, ORF) de 348 pb, o que corresponde a uma prote??na de 115 amino??cidos com um suposto pept??deo sinal de 24 amino??cidos e com um pept??deo maduro de 91 amino??cidos. Dez res??duos de ciste??nas respons??veis pela forma????o de cinco pontes dissulfeto, dois s??tios de N-glicosila????o e tr??s res??duos de prolinas apresentaram-se altamente conservados quando comparados com outras esp??cies de peixes. A compara????o baseada em sequ??ncias de amino??cidos de GTHα de 38 esp??cies de peixes revelou alta identidade do A. gigas com membros das seguintes ordens: Acipenseriformes, Anguiliformes, Siluriformes e Cypriniformes (87,1-89,5%), e, a menor identidade com os Gadiformes e Cyprinodontiformes (55%). A identidade com a an??loga sequ??ncia de GTHα de Homo sapiens foi de 67%. Para a subunidade ag-FSHβ, a ORF correspondente foi de 381 pb, produzindo uma prote??na de 126 amino??cidos com um pept??deo sinal de 18 e um pept??deo maduro de 108 amino??cidos. Quando comparado com as sequ??ncias de Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii e Homo sapiens, o pept??deo maduro de ag-FSHβ mostrou conter 12 res??duos de ciste??nas respons??veis pela forma????o de seis pontes dissulfeto, duas prolinas e um s??tio de glicosila????o perfeitamente conservados, apresentando identidades de 63, 50 e 45% respectivamente em suas sequ??ncias de amino??cidos. As ??rvores filogen??ticas constru??das mostraram, em geral, que o A. gigas, da ordem dos Osteoglossiformes, se apresenta como grupo irm??o dos Clupeocefala, enquanto os Elopomorpha (Anguiliformes) formam o grupo mais basal de todos os tele??steos aqui analisados.