Express??o, purifica????o e caracteriza????o f??sico-qu??mica da rhBMP-2 (recombinante humana BMP-2)

• Autor(a) principal: AMARAL, KLEICY C.
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/30313
• topic: biochemistry; protein engineering; interaction cells; skeleton; molecular biology; escherichia coli; bacteria; high-performance liquid chromatography; physical chemistry; testing; performance

As prote??nas morfogen??ticas ??sseas (BMPs) s??o um grupo proteico pertencente ?? superfam??lia dos fatores transformadores de crescimento beta (TGF-??). Dentre estas, a BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2) tem sido amplamente estudada, devido suas propriedades osteoindutoras. J?? existe a comercializa????o desta prote??na produzida por tecnologia de DNA recombinante em c??lulas de ov??rio de hamster chin??s (CHO) e para fins de pesquisa, a expressa no citoplasma de bact??rias Escherichia coli (E. coli). A rhBMP-2 na sua forma homodim??rica possui alta atividade biol??gica, induzindo a mineraliza????o ??ssea em ossos endocondrais e a diferencia????o de c??lulas mesenquimais em osteoblastos e osteoclastos. O objetivo desse trabalho consistiu em obter a rhBMP-2 atrav??s da produ????o em bact??rias E. coli, altamente purificada atrav??s de t??cnicas cromatogr??ficas e com atividade biol??gica. As cepas utilizadas para produ????o foram a W3110 e a BL21(DE), transformadas com plasm??deos contendo o cDNA da hBMP-2 cultivadas em tr??s temperaturas de express??o: 25 ??C, 37 ??C e 42 ??C. Para purifica????o dessa prote??na foram utilizadas duas t??cnicas cromatogr??ficas: afinidade a heparina e exclus??o molecular por cromatografia l??quida de alto desempenho (HPSEC). As coletas destas etapas de purifica????o levaram a separa????o de oito produtos que foram caracterizados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western Blotting (WB). A atividade biol??gica foi averiguada por produ????o de fosfatase alcalina em c??lulas miobl??sticas de camundongo (C2C12). A avalia????o dos produtos comerciais tamb??m foi feita atrav??s dessas t??cnicas. Os resultados indicaram que dois dos oito produtos purificados, um obtido a partir da produ????o na cepa BL21(DE) ?? 25 ??C e outro da produ????o na cepa W3110 ?? 42 ??C, apresentaram relevante grau de pureza e atividade biol??gica.