Estudo dos perfis de N-glicosila????o da prolactina recombinante humana expressa em c??lulas humanas HEK293

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: SILVA, FELIPE D.
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/29634
Resumo: A prolactina humana (hPRL) ?? um horm??nio sintetizado pela hip??fise com in??meras fun????es tais como: lacta????o, reprodu????o e regula????o osm??tica. Este horm??nio ?? frequentemente dosado em casos de problemas na lacta????o, infertilidade, al??m de estudos que elucidam sua liga????o em alguns tipos de c??ncer (mama, pr??stata e ??tero). A hPRL ?? encontrada na forma n??o glicosilada (NG-hPRL) (23 kDa) e glicosilada (G-hPRL) (25 kDa), sendo a isoforma glicosilada um modelo ideal de an??lise de perfil de N-glicanos, j?? que possui um ??nico s??tio de glicosila????o localizado na Asparagina 31. A glicosila????o est?? relacionada diretamente ?? solubilidade, ?? estabilidade, ao enovelamento, ?? meia-vida e atividade biol??gica in vivo. As c??lulas de ov??rio de hamster chin??s (CHO) e as c??lulas embrion??rias de rim humano (HEK293) s??o os hospedeiros mais utilizados para express??o de prote??nas recombinantes, j?? que podem ser cultivadas em altas densidades e por possu??rem similaridade nas modifica????es p??s-traducionais. O objetivo foi expressar, purificar e realizar uma caracteriza????o f??sico-qu??mica e biol??gica da hPRL glicosilada de c??lulas HEK293, incluindo an??lise da estrutura de carboidratos. Para tanto, foi realizada uma transfec????o em c??lulas HEK293T (aderidas) com o vetor pcDNA 3.4-TOPO. Foi obtida uma express??o de 21,26 ?? 8,3 ??g/mL de hPRL no meio condicionado sem soro. A hPRL foi purificada por cromatografia de afinidade a metais imobilizados (IMAC), eluindo 92% da hPRL em uma ??nica fra????o que, analisada por HPSEC, apresentou pureza de 97%. O perfil de N-glicanos da amostra apresentou seis esp??cies, todas com termina????o em ??cido-si??lico, do tipo complexo, sendo bi, tri e tetra-anten??rias, com relativa predomin??ncia da esp??cie N2G2S1 (29,4%). A bioatividade in vitro da G-hPRL HEK293 demonstrou ser ??? 16 vezes menor que a G-hPRL produzida em c??lulas CHO.
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No. of bitstreams: 0Disserta????o (Mestrado em Tecnologia Nuclear)IPEN/DInstituto de Pesquisas Energ??ticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP75embryonic cellsanimal cellskidneysescherichia coliglycosyl transferaseslthgonadotropinshigh-performance liquid chromatographyEstudo dos perfis de N-glicosila????o da prolactina recombinante humana expressa em c??lulas humanas HEK293Study of N-glycosylate profiles of human recombinant prolactin expressed in human cells HEK293info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisNS??o Pauloinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional do IPENinstname:Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN)instacron:IPEN25463SILVA, FELIPE D.19-02http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-28092018-142442/pt-br.php14230SILVA, FELIPE D.:14230:810:SLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-81748http://repositorio.ipen.br/bitstream/123456789/29634/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51123456789/296342020-06-04 15:40:59.668oai:repositorio.ipen.br:123456789/29634Tk9URTogUExBQ0UgWU9VUiBPV04gTElDRU5TRSBIRVJFClRoaXMgc2FtcGxlIGxpY2Vuc2UgaXMgcHJvdmlkZWQgZm9yIGluZm9ybWF0aW9uYWwgcHVycG9zZXMgb25seS4KCk5PTi1FWENMVVNJVkUgRElTVFJJQlVUSU9OIExJQ0VOU0UKCkJ5IHNpZ25pbmcgYW5kIHN1Ym1pdHRpbmcgdGhpcyBsaWNlbnNlLCB5b3UgKHRoZSBhdXRob3Iocykgb3IgY29weXJpZ2h0Cm93bmVyKSBncmFudHMgdG8gRFNwYWNlIFVuaXZlcnNpdHkgKERTVSkgdGhlIG5vbi1leGNsdXNpdmUgcmlnaHQgdG8gcmVwcm9kdWNlLAp0cmFuc2xhdGUgKGFzIGRlZmluZWQgYmVsb3cpLCBhbmQvb3IgZGlzdHJpYnV0ZSB5b3VyIHN1Ym1pc3Npb24gKGluY2x1ZGluZwp0aGUgYWJzdHJhY3QpIHdvcmxkd2lkZSBpbiBwcmludCBhbmQgZWxlY3Ryb25pYyBmb3JtYXQgYW5kIGluIGFueSBtZWRpdW0sCmluY2x1ZGluZyBidXQgbm90IGxpbWl0ZWQgdG8gYXVkaW8gb3IgdmlkZW8uCgpZb3UgYWdyZWUgdGhhdCBEU1UgbWF5LCB3aXRob3V0IGNoYW5naW5nIHRoZSBjb250ZW50LCB0cmFuc2xhdGUgdGhlCnN1Ym1pc3Npb24gdG8gYW55IG1lZGl1bSBvciBmb3JtYXQgZm9yIHRoZSBwdXJwb3NlIG9mIHByZXNlcnZhdGlvbi4KCllvdSBhbHNvIGFncmVlIHRoYXQgRFNVIG1heSBrZWVwIG1vcmUgdGhhbiBvbmUgY29weSBvZiB0aGlzIHN1Ym1pc3Npb24gZm9yCnB1cnBvc2VzIG9mIHNlY3VyaXR5LCBiYWNrLXVwIGFuZCBwcmVzZXJ2YXRpb24uCgpZb3UgcmVwcmVzZW50IHRoYXQgdGhlIHN1Ym1pc3Npb24gaXMgeW91ciBvcmlnaW5hbCB3b3JrLCBhbmQgdGhhdCB5b3UgaGF2ZQp0aGUgcmlnaHQgdG8gZ3JhbnQgdGhlIHJpZ2h0cyBjb250YWluZWQgaW4gdGhpcyBsaWNlbnNlLiBZb3UgYWxzbyByZXByZXNlbnQKdGhhdCB5b3VyIHN1Ym1pc3Npb24gZG9lcyBub3QsIHRvIHRoZSBiZXN0IG9mIHlvdXIga25vd2xlZGdlLCBpbmZyaW5nZSB1cG9uCmFueW9uZSdzIGNvcHlyaWdodC4KCklmIHRoZSBzdWJtaXNzaW9uIGNvbnRhaW5zIG1hdGVyaWFsIGZvciB3aGljaCB5b3UgZG8gbm90IGhvbGQgY29weXJpZ2h0LAp5b3UgcmVwcmVzZW50IHRoYXQgeW91IGhhdmUgb2J0YWluZWQgdGhlIHVucmVzdHJpY3RlZCBwZXJtaXNzaW9uIG9mIHRoZQpjb3B5cmlnaHQgb3duZXIgdG8gZ3JhbnQgRFNVIHRoZSByaWdodHMgcmVxdWlyZWQgYnkgdGhpcyBsaWNlbnNlLCBhbmQgdGhhdApzdWNoIHRoaXJkLXBhcnR5IG93bmVkIG1hdGVyaWFsIGlzIGNsZWFybHkgaWRlbnRpZmllZCBhbmQgYWNrbm93bGVkZ2VkCndpdGhpbiB0aGUgdGV4dCBvciBjb250ZW50IG9mIHRoZSBzdWJtaXNzaW9uLgoKSUYgVEhFIFNVQk1JU1NJT04gSVMgQkFTRUQgVVBPTiBXT1JLIFRIQVQgSEFTIEJFRU4gU1BPTlNPUkVEIE9SIFNVUFBPUlRFRApCWSBBTiBBR0VOQ1kgT1IgT1JHQU5JWkFUSU9OIE9USEVSIFRIQU4gRFNVLCBZT1UgUkVQUkVTRU5UIFRIQVQgWU9VIEhBVkUKRlVMRklMTEVEIEFOWSBSSUdIVCBPRiBSRVZJRVcgT1IgT1RIRVIgT0JMSUdBVElPTlMgUkVRVUlSRUQgQlkgU1VDSApDT05UUkFDVCBPUiBBR1JFRU1FTlQuCgpEU1Ugd2lsbCBjbGVhcmx5IGlkZW50aWZ5IHlvdXIgbmFtZShzKSBhcyB0aGUgYXV0aG9yKHMpIG9yIG93bmVyKHMpIG9mIHRoZQpzdWJtaXNzaW9uLCBhbmQgd2lsbCBub3QgbWFrZSBhbnkgYWx0ZXJhdGlvbiwgb3RoZXIgdGhhbiBhcyBhbGxvd2VkIGJ5IHRoaXMKbGljZW5zZSwgdG8geW91ciBzdWJtaXNzaW9uLgo=Repositório InstitucionalPUBhttp://repositorio.ipen.br/oai/requestbibl@ipen.bropendoar:45102020-06-04T15:40:59Repositório Institucional do IPEN - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN)false
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