Clonagem, expressao, purificacao e caracterizacao estrutural da proteina ribossomal L10 humana recombinante

• Autor(a) principal: PEREIRA, LARISSA M.
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/9478
• topic: ribosomal rna; proteins; cloning; carcinomas; cell cultures; gene therapy; molecular biology

A prote??na ribossomal L10 (RP L10) ?? uma forte candidata a ser inclu??da na classe de prote??nas supressoras de tumor. Tamb??m denominada QM, a prote??na em quest??o ?? conhecida por participar da liga????o das subunidades ribossomais 60S e 40S e da tradu????o de mRNAs. Possui massa molecular entre 24 a 26 kDa e ponto isoel??trico (pI) 10,5. A seq????ncia da prote??na QM ?? bastante conservada em mam??feros, plantas, invertebrados, insetos e leveduras indicando que esta possui fun????es cr??ticas na c??lula. Com fun????o supressora de tumor, a prote??na RP L10 foi estudada em linhagens de tumor de Wilm (WT-1) e em c??lulas tumorais de est??mago, nas quais se observou uma diminui????o na quantidade de seu mRNA. Mais recentemente a RP L10 foi encontrada em baixas quantidades nos est??gios iniciais de adenoma de pr??stata e com uma muta????o em c??ncer de ov??rio, indicando uma participa????o no desenvolvimento destas doen??as. Como prote??na, j?? foi descrito que esta interage com as prote??nas c-Jun e c-Yes, inibindo a a????o ativadora de fatores de crescimento e divis??o celular. Este trabalho tem um papel importante no estabelecimento da express??o desta prote??na sol??vel, para estudos posteriores que tenham como objetivo avaliar a a????o de regi??es espec??ficas que atuam na liga????o das subunidades ribossomais 60S e 40S e tradu????o, bem como nas regi??es que se ligam a proto-oncogenes. O cDNA para prote??na QM foi amplificado por PCR e clonado no vetor de express??o peripl??smica p3SN8. A prote??na QM foi expressa em E.coli BL21 (DE3) no citoplasma e periplasma bacteriano e na melhor condi????o, a express??o de QM de bact??rias transformadas pelo plasm??deo recombinante p1813_QM em 25??C ou 30??C, a prote??na foi obtida sol??vel e com quantidad es muito pequenas de contaminantes. Os ensaios de estrutura secund??ria demonstraram que a prote??na QM tem predomin??ncia de a-h??lice, mas quando do seu desenovelmento, essa condi????o muda e a prote??na passa a ter caracter??stica de folhas β.