Clonagem, expressão, purificação e ensaio biológico da proteína GM-CSF : fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos

• Autor(a) principal: Schwanke, Raquel Cristina
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS
• Texto Completo: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5319
• topic: BIOLOGIA CELULAR; PROTEÍNAS; BIOFARMACÊUTICA; GENES; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL

O fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina pertencente a um grupo de glicoproteínas que regula a proliferação e a diferenciação de células hematopoiéticas, mais especificamente macrófagos e granulócitos. O GM-CSF humano é uma proteína de 14,5 kDa constituída de 127 aminoácidos e possui 52% de similaridade com a proteína de rato. A proteína humana possui 4 resíduos de cisteína formando duas pontes dissulfeto, porém apenas as cisteínas 54 e 96 são requeridas para a atividade biológica da mesma. Este biofármaco tem sido usado em pacientes neutropênicos que receberam altas doses de quimioterapia ou transplantados. Além disso, GM-CSF é usado para restabelecer disfunções hematopoiéticas, estimular a hiper-produção de células efetoras pré-induzidas ( primed ) funcionalmente e promover a defesa do hospedeiro contra doenças infecciosas e malignas. O uso dos mesmos está relacionado à redução no número de infecções associadas à quimioterapia, no uso de antibióticos e no tempo total de internação do paciente bem como no número de mortes. A patente internacional do biofármaco Molgramostima (nome genérico) expirou em 2006 e, além disso, tornou-se um interessante produto para indústrias farmacêuticas, inclusive para aquelas estabelecidas no Brasil. Molgramostima é vendida no Brasil como um biofármaco importado, o qual, desta forma, torna-se muito custoso para o governo brasileiro. Contudo, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma metodologia para a posterior produção industrial de uma molgramostima a nível nacional. Neste trabalho, o gene para o hGM-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET30a(+) e expresso na cepa BL21(DE3) de Escherichia coli na sua forma insolúvel. Para o isolamento e solubilização dos corpos de inclusão um eficiente protocolo foi desenvolvido utilizando múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente duas colunas cromatográficas de troca catiônica e aniônica, respectivamente. O teste de atividade biológica in vitro demonstrou que o rhGM-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi obtida por meio de um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em procedimento industrial e para saúde da população