Clonagem, superexpressão, purificação e caracterização da proteína recombinante humana fator estimulador de colônias de granulócitos

• Autor(a) principal: Vanz, Ana Letícia de Souza
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS
• Texto Completo: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5309
• topic: BIOLOGIA MOLECULAR; PROTEÍNAS; CÉLULAS; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL

O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é uma citocina hematopoiética que age sobre a linhagem de neutrófilos promovendo proliferação e diferenciação de seus precursores e ativação dos neutrófilos maduros. O G-CSF é uma proteína com 18,8 kDa, constituída por 174 aminoácidos possuindo duas pontes dissulfeto intra-moleculares e uma cisteína livre no resíduo 17. Este biofármaco tem sido empregado com sucesso em pacientes com câncer que recebem altas doses de quimioterapia. Além disso, também tem sido usado como tratamento ou profilaticamente a fim de reforçar o sistema imune em pacientes com HIV, pneumonia, pacientes diabéticos com infecções nos pés, leucemia e neutropenia febril. Em função desta ampla aplicação clínica, hG-CSF recombinante tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli e foi aprovado para uso em neutropenia provocada por quimioterapia pelo FDA em 1991. Filgrastima (nome genérico do G-CSF) teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo das indústrias farmacêuticas. Atualmente, o Brasil é totalmente dependente da importação deste biofármaco. Logo, o objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para a posterior produção de uma Filgrastima nacional. Neste trabalho, o gene para hG-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET23a(+), usando as enzimas de restrição NdeI e BamHI. Os testes de superexpressão foram realizados em diferentes cepas de E. coli, mostrando a melhor condição de expressão na fração insolúvel na cepa BL21(DE3). Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusão e purificar a proteína, inúmeros protocolos foram testados. Por fim, foi descrito um eficiente protocolo de isolamento e solubilização dos corpos de inclusão por um processo de múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente uma coluna cromatográfica de troca catiônica. A identidade da proteína foi confirmada por seqüenciamento N-terminal e Western blotting. A caracterização do rhG-CSF homogêneo, através de SEC-HPLC e RP-HPLC, mostrou resultados similares aos do padrão internacional. O teste de atividade biológica, in vivo, demonstrou que o rhG-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi produzida por um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em um processo industrial, podendo trazer benefícios para a saúde da população.